結(jié)直腸腺癌中神經(jīng)內(nèi)分泌細胞克隆性起源的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，而神經(jīng)內(nèi)分泌分化(neuroendocrinedifferentiation，NED)廣泛存在于一般的非內(nèi)分泌組織、良性腫瘤及惡性腫瘤組織中。結(jié)直腸腺癌中NED的發(fā)生率約為41.5％。目前，國內(nèi)外學者對伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化腺癌的研究僅限于腺癌細胞，而對于散在的NE細胞研究較少，特別是用分子遺傳學方法研究腺癌中單個NE細胞的起源方面尚未見報道，NE細胞是否存在染色體及相關基因表達水平的改變，它們是否為腫瘤的一種

2、成分，尚不清楚。近年來，關于腺癌中NE細胞組織起源的問題主要存在兩種不同的假說。一種假說認為，腺癌細胞和NE細胞分別起源于多潛能干細胞和原發(fā)性神經(jīng)內(nèi)分泌癌;另一種假說認為，腺癌細胞和NE細胞均來源于內(nèi)胚層多潛能干細胞，在腫瘤發(fā)生及演進過程中，內(nèi)胚層的多能干細胞受激素、局部微環(huán)境及基因組不穩(wěn)定性的影響，使某些被調(diào)節(jié)基因抑制的基因組密碼發(fā)生隨機脫抑制，在RNA轉(zhuǎn)錄水平選擇性的激活兩種以上的調(diào)節(jié)基因，產(chǎn)生雙向或多向分化。明確結(jié)直腸腺癌中NE細

3、胞的起源，將有助于更深入地認識伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展的機理，從而有針對性的治療，這對于提高結(jié)直腸腺癌患者生存率及生存質(zhì)量具有重要意義。
　　 目前在腫瘤分子生物學研究中國際上很多研究都利用激光捕獲顯微切割(Laser capture microdissection， LCM)技術獲取目的細胞，對細胞數(shù)量有限的樣本則進行全基因組擴增以獲得足量DNA。激光捕獲顯微切割技術可以使研究者獲得形態(tài)完整的單一細胞或細胞群進行

4、遺傳學研究，解決了構成復雜的組織中捕獲目的細胞的難題。使用該技術即可避免鄰近細胞的污染，又由于在切除和提取細胞過程中不產(chǎn)生熱量，對目的細胞沒有任何損傷。全基因組擴增依據(jù)多重置換擴增（multiple displacement amplification，MDA）原理，采用Phi29 DNA聚合酶，保證了擴增片段的高保真性。
　　 干細胞在分化過程中，染色體有絲分裂不均衡，可造成部分基因在兩種分化的細胞中同時出現(xiàn)等位基因的改變（如

5、擴增、丟失、突變等），根據(jù)這一理論可通過檢測微衛(wèi)星改變（包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定和雜合性丟失）及突變等來推測組織細胞的克隆性起源。
　　 我們采用嗜鉻素A(CgA)標記新鮮結(jié)直腸腺癌組織中NE細胞，以激光捕獲顯微切割儀切割目的細胞，應用DNA抽提和全基因組擴增，在全基因組范圍內(nèi)選取多個微衛(wèi)星位點，通過檢測NE細胞和腺癌細胞的微衛(wèi)星不穩(wěn)定、雜合性缺失并聯(lián)合p53突變的檢測，對結(jié)直腸腺癌中NE細胞進行分子水平的研究，以期探討NE細胞的克隆性

6、起源。
　　 材料和方法：
　　 本實驗收集浙江省諸暨市人民醫(yī)院2008-2009年間56例結(jié)直腸腺癌新鮮腫瘤標本及距離腫瘤2cm以上正常組織各一塊。首先用冰凍切片-CgA免疫組織化學染色，檢出30例伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化結(jié)直腸腺癌標本，用激光捕獲顯微切割儀切割NE細胞，每一例樣本捕獲200個左右單個NE細胞。應用DNA Micro-kit抽提試劑盒及Repli-g全基因組擴增試劑盒對捕獲的NE細胞進行DNA抽提和全基因組放大

7、以獲得大量DNA，在全基因組范圍內(nèi)選取26個微衛(wèi)星位點，結(jié)合PCR-SSCP-銀染色檢測腺癌細胞和NE細胞微衛(wèi)星不穩(wěn)定、雜合性缺失，聯(lián)合PCR-測序檢測p53基因突變發(fā)生情況，推測結(jié)直腸腺癌中NE細胞的克隆性起源。另外，結(jié)合臨床病理資料，綜合分析微衛(wèi)星改變和p53基因突變的臨床病理意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、免疫組化-激光顯微切割結(jié)果:56例結(jié)直腸腺癌新鮮標本中檢出30例伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化的樣本，在20倍物鏡下進行激光

8、顯微切割，每個腺癌樣本捕獲了200個左右單個NE細胞。
　　 2、微衛(wèi)星結(jié)果分析:30例樣本MSI總發(fā)生率為16.9％，LOH總發(fā)生率為8.5％，各樣本MSI發(fā)生率高于LOH。統(tǒng)計結(jié)果顯示，樣本中腺癌細胞和NE細胞的MSI及LOH發(fā)生率一致。30例樣本中，第3、5、16、18、24、26例樣本在NE細胞和腺癌細胞中發(fā)生了完全一致的微衛(wèi)星改變，其余24例樣本均有不同程度的MSI及LOH一致性。樣本中兩種細胞微衛(wèi)星改變一致性與不一致

9、性的差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　 3、p53突變情況:30例樣本p53總突變率為16.7％。 p53突變出現(xiàn)在外顯子5、7和8。第1、4、14、15、27例樣本中NE細胞和腺癌細胞均發(fā)生了一致的p53突變。
　　 4、微衛(wèi)星改變、p53突變與臨床病理參數(shù)間的關系:微衛(wèi)星改變發(fā)生率與結(jié)直腸腺癌的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關性（P＞0.05）。p53突變與結(jié)直腸癌TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(