去神經(jīng)支配后對(duì)鼠肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞（PNEC）系統(tǒng)是由單個(gè)PNEC及成簇的PNEC形成的神經(jīng)上皮小體（NEB）組成。已知PNEC具有氣道氧化學(xué)感受器，調(diào)節(jié)氣道反應(yīng)性，促進(jìn)肺的生長(zhǎng)發(fā)育的功能。近來(lái)還發(fā)現(xiàn)PNEC可作為氣道上皮干細(xì)胞促進(jìn)肺損傷后修復(fù)，PNEC與小細(xì)胞肺癌密切相關(guān)。這些功能的發(fā)揮主要通過(guò)迷走神經(jīng)節(jié)的感覺(jué)傳入神經(jīng)纖維支配。
　　NEB中存在雙重感覺(jué)神經(jīng)纖維支配。一是由迷走神經(jīng)結(jié)狀神經(jīng)節(jié)的鈣結(jié)合蛋白D28K和P2X3受體免疫神經(jīng)纖維組成的感覺(jué)

2、神經(jīng)纖維；另一是由背根神經(jīng)節(jié)的P物質(zhì)和降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）免疫反應(yīng)性神經(jīng)纖維組成。CGRP在神經(jīng)節(jié)中合成后隨之被轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)末梢，通過(guò)迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)元調(diào)節(jié)其行為。從氣道近端至遠(yuǎn)端雙重感覺(jué)神經(jīng)纖維的密度逐漸降低直至單個(gè)神經(jīng)纖維穿過(guò)氣道上皮及上皮下層，單個(gè)PNEC及NEB可能通過(guò)粘膜下層的微細(xì)神經(jīng)纖維相互連接。單側(cè)迷走神經(jīng)切斷后會(huì)出現(xiàn)同側(cè)的神經(jīng)末梢退化或消失，PNEC及NEB也可能會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)改變。
　　臨床在氣管、支氣管成形術(shù)

3、及肺移植過(guò)程中，由于切斷了支配支氣管粘膜及肌肉的神經(jīng)纖維，去神經(jīng)支配后肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的數(shù)量、分布及神經(jīng)活性物質(zhì)分泌功能的改變；PNEC對(duì)于神經(jīng)刺激的應(yīng)答，PNEC產(chǎn)生的神經(jīng)免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌的功能，以及這些改變對(duì)于氣管、支氣管粘膜的修復(fù)有何影響？目前尚不清楚。因此，研究去神經(jīng)支配后肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量、分布及神經(jīng)活性物質(zhì)的分泌功能的改變，具有十分重要的意義。
　　研究目的
　　通過(guò)切斷鼠單側(cè)迷走神經(jīng)和支氣管重建觀察去神經(jīng)后P

4、NEC和NEB的數(shù)量、形態(tài)結(jié)構(gòu)及其分泌神經(jīng)活性物質(zhì)的變化，以探討PNEC的功能及其在氣道損傷及修復(fù)中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1．30只SD大鼠切斷左側(cè)迷走神經(jīng)，術(shù)后按取樣時(shí)間隨機(jī)分為術(shù)后一周、一月、三月組，每組10只；另設(shè)10只正常SD大鼠作為對(duì)照組。電鏡觀察肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；采用Grimelius銀染色法觀察肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量及分布；免疫組化法檢測(cè)五羥色胺陽(yáng)性神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、降鈣素基因相關(guān)肽陽(yáng)性神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)

5、胞的表達(dá)；采用放射免疫分析法測(cè)定血清中CGRP濃度；RT-PCR法測(cè)定肺組織CGRPmRNA表達(dá)。
　　2．30只SD大鼠左側(cè)支氣管重建術(shù)，術(shù)后按取樣時(shí)間隨機(jī)分為術(shù)后一周、一月、三月組，每組10只；另設(shè)10只正常SD大鼠作為對(duì)照組。HE切片觀察支氣管重建術(shù)后支氣管愈合情況；采用Grimelius銀染色法觀察肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量及分布；免疫組化法檢測(cè)五羥色胺陽(yáng)性神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、降鈣素基因相關(guān)肽陽(yáng)性神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的表達(dá)；采用放射免疫分

6、析法測(cè)定血清中CGRP濃度；RT-PCR法測(cè)定肺組織CGRPmRNA表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1．PNEC超微結(jié)構(gòu)：電鏡下見(jiàn)PNEC分布于肺內(nèi)支氣管和細(xì)支氣管上皮內(nèi)，PNEC呈燒瓶樣、卵圓形和錐型，細(xì)胞從上皮基底膜延伸至支氣管管腔或者沿基底膜在相鄰氣道上皮間伸展，頂端狹窄形成尖形突起抵達(dá)管腔，有些細(xì)胞頂端靠近腔面處常有短微絨毛。在細(xì)胞漿中富含具有特征性的致密核心小泡（DCV），一般呈球狀，直徑約70～200nm，外被單位膜，

7、內(nèi)含電子高密度的核心，核心和膜之間有一薄的光暈。PNEC內(nèi)可見(jiàn)數(shù)量不等的游離核蛋白體、光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、成束的微絲和線(xiàn)粒體，線(xiàn)粒體較相鄰細(xì)胞的更小，高爾基體位于細(xì)胞核靠上處。
　　2．迷走神經(jīng)切斷術(shù)后一周和一月Grimelius銀染色見(jiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞多位于肺內(nèi)支氣管上皮，其數(shù)量大幅度增加，且有多個(gè)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞聚集形成神經(jīng)上皮小體；至三月接近正常對(duì)照組；進(jìn)一步免疫組化檢測(cè)見(jiàn)迷走神經(jīng)切斷術(shù)后一周、一月大支氣管內(nèi)5-HT、CGR

8、P陽(yáng)性PNEC和NEB數(shù)量大量增加（P﹤0.01），至術(shù)后三月時(shí)接近正常對(duì)照組（P﹥0.05）。小支氣管、周?chē)?xì)支氣管內(nèi)5-HT、CGRP陽(yáng)性PNEC和NEB數(shù)量無(wú)顯著差異（P﹥0.05）。
　　3．迷走神經(jīng)切斷術(shù)后一周和一月血清CGRP含量比正常對(duì)照組顯著降低（P﹤0.01），隨著時(shí)間延長(zhǎng)，血清中CGRP含量逐漸增加，至三月時(shí)接近正常對(duì)照組；而肺組織CGRPmRNA表達(dá)在術(shù)后一周和一月均明顯高于對(duì)照組（P﹤0.01），隨著時(shí)間的

9、延長(zhǎng)，其表達(dá)量逐漸減少，至術(shù)后三月時(shí)接近正常對(duì)照組（P﹥0.05）。
　　4．支氣管重建術(shù)后支氣管吻合口肉芽組織增生，可見(jiàn)支氣管粘膜中斷，內(nèi)皮細(xì)胞增生形成的實(shí)性細(xì)胞索及擴(kuò)張的毛細(xì)血管，毛細(xì)血管周?chē)梢?jiàn)大量的纖維母細(xì)胞及炎性細(xì)胞。
　　5．支氣管重建術(shù)后一周和一月Grimelius銀染色見(jiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞多位于肺內(nèi)支氣管上皮，其數(shù)量大幅度增加，且有多個(gè)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞聚集形成神經(jīng)上皮小體；至三月接近正常對(duì)照組；進(jìn)一步免疫組化檢測(cè)見(jiàn)

10、支氣管重建術(shù)后一周、一月大支氣管內(nèi)5-HT、CGRP陽(yáng)性PNEC和NEB數(shù)量大量增加（P﹤0.01），至術(shù)后三月時(shí)接近正常對(duì)照組（P﹥0.05）。小支氣管、周?chē)?xì)支氣管內(nèi)5-HT、CGRP陽(yáng)性PNEC和NEB數(shù)量無(wú)顯著差異（P﹥0.05）。6．支氣管重建術(shù)后一周和一月血清CGRP含量比正常對(duì)照組顯著降低（P﹤0.01），隨著時(shí)間延長(zhǎng)，血清中CGRP含量逐漸增加，至三月時(shí)接近正常對(duì)照組；而肺組織CGRPmRNA表達(dá)在術(shù)后一周和一月均明顯高

11、于對(duì)照組（P﹤0.01），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量逐漸減少，至術(shù)后三月時(shí)接近正常對(duì)照組（P﹥0.05）。
　　結(jié)論
　　1．神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征——細(xì)胞漿中致密核心小泡（DCV）可作為PNEC特征性標(biāo)志。
　　2．迷走神經(jīng)切斷后可明顯影響肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)量、分布及神經(jīng)活性物質(zhì)的分泌，從而表明迷走神經(jīng)具有支配、調(diào)節(jié)肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分化及分泌神經(jīng)活性物質(zhì)的功能。
　　3．迷走神經(jīng)切斷后血清內(nèi)CGRP濃度下降

12、及肺內(nèi)CGRPmRNA表達(dá)量增加之變化，表明迷走神經(jīng)對(duì)CGRP基因的表達(dá)和神經(jīng)活性物質(zhì)CGRP的分泌具有調(diào)節(jié)作用。
　　4．支氣管重建術(shù)后PNEC的數(shù)量增加及5-HT，CGRP陽(yáng)性PNEC和NEB大量增生，一方面表明PNEC受其支配的神經(jīng)纖維調(diào)節(jié)，另一方面表明PNEC可能參與了氣道的損傷與修復(fù)。
　　5．支氣管重建術(shù)后近期血清內(nèi)CGRP濃度下降及肺內(nèi)CGRPmRNA表達(dá)量增加之變化，表明肺內(nèi)CGRP-IR神經(jīng)纖維調(diào)節(jié)CGRP