雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)反應(yīng)調(diào)節(jié)子DevR的表達(dá)與結(jié)核分枝桿菌耐藥的關(guān)系研究.pdf

1、背景：結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害公眾健康和威脅人類生存的傳染病。我國是全球結(jié)核病疫情最嚴(yán)重的國家之一，也是結(jié)核病耐藥負(fù)擔(dān)最重的國家之一。因此研究結(jié)核病的耐藥機(jī)制，對于結(jié)核病的防控具有重要意義。我們前期利用LC-MS/MS對臨床分離的結(jié)核分枝桿菌敏感株、異煙肼單耐藥菌株和耐多藥菌株的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)子 DevR在臨床分離的耐多藥菌株中表達(dá)明顯升高。DevR是結(jié)核分枝桿菌重要的休眠調(diào)控因子，而

2、休眠能導(dǎo)致結(jié)核菌對多種藥物耐藥，提示DevR可能與結(jié)核分枝桿菌耐藥密切相關(guān)。因此，本課題擬在前期工作的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步驗證DevR的表達(dá)與結(jié)核分枝桿菌耐藥的關(guān)系。
　　目的：
　　1.鑒定結(jié)核分枝桿菌devR的表達(dá)水平與藥敏表型的關(guān)系。
　　2.明確不同耐藥表型菌株的遺傳背景對devR的表達(dá)影響。
　　3.闡明devR的表達(dá)變化對結(jié)核分枝桿菌耐藥性的影響。
　　方法：
　　1.將培養(yǎng)至對數(shù)生長早期的3

3、2株結(jié)核分枝桿菌敏感菌株、18株異煙肼單耐藥菌株、2株利福平單耐藥菌株和45株耐多藥菌株的總RNA進(jìn)行提取，然后利用熒光定量PCR檢測devR的表達(dá)水平；分別向培養(yǎng)至對數(shù)長早期的6株敏感菌株中，分別加入其1/2 MIC濃度的異煙肼、利福平、鏈霉素或乙胺丁醇，以7H9培養(yǎng)基作為對照，誘導(dǎo)培養(yǎng)2小時后，檢測devR基因的表達(dá)量。
　　2.對97株臨床分離的結(jié)核分枝桿菌菌株及標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv株進(jìn)行基因組DNA的提??；然后，對菌株基因組D

4、NA的15個MIRU-VNTR位點進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增結(jié)果上傳至MIRU-VNTR Plus數(shù)據(jù)庫；最終，利用系統(tǒng)基因樹分析對菌株的基因型進(jìn)行鑒定。
　　3.利用Devsilab rep-PCR對97株結(jié)核分枝桿菌菌株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得每株菌的DNA指紋圖譜；最終，利用Deversilab在線分析軟件（Version3.4）將所有菌株DNA指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。
　　4.對devR上游的啟動子區(qū)進(jìn)行預(yù)測，并利

5、用PCR對97株臨床分離菌株的devR啟動子區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；然后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定并進(jìn)行比對分析。
　　5.將可表達(dá)噬菌體重組酶CheC60-61的質(zhì)粒pJV53電轉(zhuǎn)化入M.bovisBCG菌株，以獲得重組的M.bovis BCG菌株。
　　6.將devR的上、下游同源臂連接在博萊霉素篩選標(biāo)簽的兩側(cè)，以獲得devR的突變子；然后，將devR的突變子電轉(zhuǎn)化入重組的M.bovis BCG菌株；最后，利用PCR和測序鑒定devR敲

6、除菌株。
　　7.利用結(jié)核分枝桿菌穿梭表達(dá)載體pMN437構(gòu)建devR的過表達(dá)載體；然后，將devR過表達(dá)載體Pmn437devR電轉(zhuǎn)化入M.bovis BCG菌株；最終，利用PCR和熒光顯微鏡等技術(shù)對devR的過表達(dá)菌株進(jìn)行篩選和鑒定。
　　8.利用刃天青顯色藥敏法檢測野生型BCG、devR高表達(dá)菌株和devR缺失表達(dá)菌株的MIC。
　　結(jié)果：
　　1.定量PCR的檢測結(jié)果顯示：在INH單耐藥菌株和MDR菌株中

7、，devR的表達(dá)量明顯升高（p<0.05），分別是敏感株的1.42倍和7.36倍。INH、RIF和EMB菌株分別誘導(dǎo)臨床分離的敏感菌株后，devR的表達(dá)量明顯升高，其平均相對表達(dá)量均超過了對照組的2倍。
　　2. MIRU-VNTR基因分型結(jié)果顯示：本研究所收集的臨床分離菌株均為北京基因型，但本實驗所保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv株與H37Rv原始株比較，在MIRU-26、Mtub39和QUB4156位點上出現(xiàn)了重復(fù)序列拷貝數(shù)的變異，但

8、經(jīng)系統(tǒng)基因樹鑒定仍屬于H37Rv菌株。
　　3.將Devsilab rep-PCR獲得的DNA指紋圖譜聚類分析，結(jié)果顯示：本實驗室所保存的結(jié)核分枝桿菌菌株的基因型呈現(xiàn)明顯的多態(tài)性；每個樣本具有獨特DNA指紋圖譜，所有菌株的總體的相似度為55％；以70%為cut-off值可將所有菌株分為8個主要的基因型，但進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)菌株基因型與其耐藥表型之間的相關(guān)性不具有統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）；此外，對臨床分離菌株的基因型（rep-PCR

9、）與devR表達(dá)量的相關(guān)性分析顯示：devR在耐藥菌株和敏感菌株間的差異表達(dá)與基因型相的相似度無關(guān)（p>0.05）。
　　4.對devR上游792bp的基因片段的測序，結(jié)果顯示：有22株菌（6敏感、4異煙肼單耐藥、12株耐多藥菌株）發(fā)生了一個A堿基的缺失突變；該突變位于devR上游-370bp處，且屬首次發(fā)現(xiàn)。此外，devR的表達(dá)與基因突變的相關(guān)性關(guān)系分析提示：devR在突變株和野生株之間不存在表達(dá)差異（p>0.05）。
　

10、　5.本研究利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了devR缺失表達(dá)的 M.bovis BCG菌株；本研究也成功構(gòu)建了devR過表達(dá)的M.bovis BCG菌株。
　　6.野生型M.bovis BCG株、devR缺失株和devR過表達(dá)株的MIC檢測結(jié)果顯示：野生株分別對異煙肼、利福平、鏈霉素和乙胺丁醇的MIC為0.06、0.17、0.5和2.6μg/ml；devR缺失株分別對異煙肼、利福平、鏈霉素和乙胺丁醇的MIC為0.06、0.20、0.33

11、和3.3μg/ml；devR過表達(dá)株分別對INH、RIF、SM和EMB的MIC為0.08、0.20、0.33和3.3μg/ml。即，這三種菌株均對一線抗結(jié)核藥物敏感。
　　結(jié)論：
　　本課題系統(tǒng)地分析了devR基因在多種耐藥表型菌株中的表達(dá)情況，首次發(fā)現(xiàn)并證實了devR在結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株中表達(dá)明顯升高，且INH、SM和EMB均可誘導(dǎo)其表達(dá)。并揭示了devR在耐藥菌株和敏感菌之間的表達(dá)差異不受菌株基因型的影響，提示其表達(dá)變