細(xì)胞毒抗腫瘤藥物的共同基因表達(dá)譜的研究.pdf

1、基因表達(dá)譜芯片技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)前沿生物技術(shù)，可以對成千上萬種基因的表達(dá)水平進(jìn)行平行、快速、準(zhǔn)確、高效的檢測?；蛐酒夹g(shù)對于藥物作用分子機(jī)制研究、藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)、多靶點(diǎn)高通量藥物篩選、藥物活性及毒性評價(jià)等領(lǐng)域具有無可比擬的優(yōu)勢。 細(xì)胞毒抗腫瘤藥物與不同的靶點(diǎn)結(jié)合后發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡的作用。雖然目前已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控分子和反應(yīng)通路，但是這些藥物作用靶點(diǎn)與細(xì)胞內(nèi)其它的調(diào)

2、控分子或反應(yīng)通路尚不完全清楚。由于不同的細(xì)胞毒抗腫瘤藥物所致的細(xì)胞表型變化相似，因此可以推測：不同的抗腫瘤藥物可能共享某些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，而這些細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)通路中的分子則可能與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)。因此，尋找新的細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控分子和反應(yīng)通路對于進(jìn)一步了解藥物的作用機(jī)制和發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)具有重要的意義。 本研究基于上述的設(shè)想，選擇了喜樹堿、紫杉醇、高三尖杉酯堿和放線菌素D作用于白血病HL-60細(xì)胞和肝癌QGY7703

3、細(xì)胞，利用基因芯片技術(shù)研究藥物反應(yīng)的基因表達(dá)譜，并應(yīng)用Genmapp分析軟件和Access軟件，對藥物反應(yīng)基因進(jìn)行聚類分析和藥物反應(yīng)通路分析。并應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR對一些重要基因進(jìn)行確證。結(jié)果如下： 1.為研究抗腫瘤藥物早期敏感反應(yīng)基因表達(dá)譜，我們首先研究4個(gè)細(xì)胞毒抗腫瘤藥物對白血病HL-60和肝癌QGY7703細(xì)胞表型的影響。采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測紫杉醇、高三尖杉酯堿、喜樹堿、放線菌素D作用于HL-60細(xì)胞和QGY-7703

4、肝癌細(xì)胞24h的藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.025、320、79.85、2.67、μmol/mL和2.26、52.77、19.09、0.48、μmol/mL；實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)表明，兩種腫瘤細(xì)胞與各藥物孵育1h，細(xì)胞形態(tài)未見變化，作用24h可見細(xì)胞破碎、數(shù)目減少；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，紫杉醇和高三尖杉酯堿作用24h可加速白血病細(xì)胞和肝癌細(xì)胞通過G1/S期，導(dǎo)致G2/M期阻和細(xì)胞凋

5、亡。 2.HL-60細(xì)胞和QGY-7703肝癌細(xì)胞分別用上述藥物的IC50處理1h后，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)加藥物溶劑的對照組。抽提細(xì)胞RNA，然后用熒光試劑制備cDNA探針，再與14400型基因表達(dá)譜芯片雜交，用ScanArray 3000掃描芯片和ImaGene 軟件分析熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值。選擇三次實(shí)驗(yàn)雜交比值的平均值自然對數(shù)絕對值≥0.69作為判定基因表達(dá)差異標(biāo)準(zhǔn)，篩選出各藥物作用的早期反應(yīng)基因。結(jié)果顯示，4個(gè)抗腫瘤藥物均誘發(fā)強(qiáng)烈的

6、細(xì)胞基因表達(dá)改變，其中紫杉醇和高三尖杉酯堿誘導(dǎo)HL-60和QGY7703細(xì)胞的反應(yīng)基因最多。 3．應(yīng)用Genmapp分析軟件對藥物反應(yīng)基因進(jìn)行聚類分析和藥物反應(yīng)通路分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)抗腫瘤藥物可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)許多反應(yīng)通路、功能基因或細(xì)胞組分。例如，紫杉醇可調(diào)控mRNA加工過程；高三尖杉酯堿可抑制蛋白酶體組分26S亞單位PSMC3、PSMD2和PSMD11表達(dá)；喜樹堿影響G蛋白信號(hào)通路中多條基因的表達(dá)；放線菌素D可調(diào)節(jié)絲裂素活化的蛋白激酶

7、(MAPK)通路、TNF-NFkB通路等，這些結(jié)果說明藥物起始靶點(diǎn)與許多已知的調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的通路相連，而這些通路可以很好地解釋藥物的作用。此外，細(xì)胞毒抗腫瘤藥物還調(diào)節(jié)了一群組織特異的基因，如喜樹堿影響一些內(nèi)臟器官、內(nèi)分泌系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基因，放線菌素D也能調(diào)節(jié)一些正常胚胎干細(xì)胞基因表達(dá)，提示這些基因的改變可能與其毒性有關(guān)。 4．應(yīng)用microsoft office Access軟件對藥物反應(yīng)基因和藥物反應(yīng)通路進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分

8、析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒抗腫瘤藥物之間在轉(zhuǎn)錄水平上可共享某些同向改變的基因或反應(yīng)通路，其中2個(gè)藥物之間最多，共用反應(yīng)基因和通路在3個(gè)藥物之間，甚至全部4個(gè)藥物都可見到，例如全部4個(gè)藥物在HL-60和QGY7703細(xì)胞中分別有17條乘140條共用反應(yīng)基因以及7條和9條反應(yīng)通路。在2個(gè)細(xì)胞系中，4個(gè)抗腫瘤藥物也有6條的共同反應(yīng)基因，它們是GRN、MLL3、PSAP、ERP29、LRPAP1、ST3GAL4，也共享肌動(dòng)蛋白—細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路和粘著斑功能

9、調(diào)節(jié)通路。這些結(jié)果提示拓樸酶抑制、微管、核糖體和DNA模板干擾在轉(zhuǎn)錄水平上具有共同的下游作用，通過這些下游通路或分子可能最終導(dǎo)致相似的表型變化。 5．共用反應(yīng)基因在功能上可分為：生長增殖相關(guān)基因、凋亡相關(guān)基因、糖代謝相關(guān)基因及其它功能基因4類，這些共用基因所編碼的蛋白生物功能多樣，分別參與了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成，能量代謝，泛素(類泛素)蛋白酶體依賴的蛋白質(zhì)降解，信號(hào)傳導(dǎo)通路、抗凋亡或促凋亡等重要的細(xì)胞生命活動(dòng)

10、以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及線粒體等構(gòu)成。 (1) 抗腫瘤藥物能顯著抑制細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞周期相關(guān)基因，如蛋白磷酸酶2A、翻譯延長因子1、HnRNPB1等，這些基因參與了細(xì)胞有絲分裂、核酸合成、DNA復(fù)制和修復(fù)以及RNA加工和蛋白質(zhì)合成：此外，還能抑制具有促增殖作用的腫瘤相關(guān)蛋白基因(如GRN、MLL3)的表達(dá)，表明抗腫瘤藥物可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖基因的表達(dá)，來抑制腫瘤細(xì)胞的生長甚至導(dǎo)致死亡； (2) 抗腫瘤藥物能誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)促凋亡基因PMAI

11、P1以及抑制抗凋亡基因PSAP的表達(dá)，說明調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)也是抗腫瘤藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要機(jī)制； (3) 抗腫瘤藥物能調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及線粒體構(gòu)成誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如ERP29是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔膜蛋白，作為氧化還原酶和分子伴侶，參與蛋白質(zhì)折疊和運(yùn)輸。ARF5是囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)包被復(fù)合體形成所必需，參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體間的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。抗腫瘤藥物抑制兩者表達(dá)，可能阻斷蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而使細(xì)胞凋亡。mitochond

12、rial ribosomal protein S18A 是線粒體核糖體組分，衰老細(xì)胞線粒體核糖體蛋白合成的準(zhǔn)確性下降。isocitrate dehydrogenase 2參與三羧酸循環(huán)，SLC25A6 為ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)子，因此，抑制參與能量代謝的基因表達(dá)可能會(huì)引起線粒體呼吸鏈功能缺陷或者ATP耗竭而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 (4)抗腫瘤藥物能抑制泛素(類泛素)蛋白體蛋白降解系統(tǒng)相關(guān)基因PSMC3、VCP 和SAE1表達(dá)。PSMC3是蛋

13、白酶體26S蛋白酶體19S調(diào)節(jié)亞基的核心組分，VCP/p97是一種AAA ATP酶，在輔助因子協(xié)助下，可使錯(cuò)誤折疊的蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脫位進(jìn)入胞漿，經(jīng)泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解。SAE1/SAE2是小泛素相關(guān)修飾劑(SUMO-1)活化酶，參與類泛素途徑調(diào)節(jié)，由于蛋白酶體參與細(xì)胞周期、增殖和凋亡調(diào)節(jié)，因此抑制泛素蛋白酶體途徑可能也是抗腫瘤藥物的一個(gè)重要機(jī)制。 (5) 抗腫瘤藥物能抑制唾液酸轉(zhuǎn)移酶4C和糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)子SLC35D1表達(dá)，而這二者均

14、在多種腫瘤中表達(dá)增加，參與腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此，抑制蛋白糖基化可能與藥物的抗轉(zhuǎn)移作用有關(guān)。文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，有些共用基因已作為抗腫瘤藥物篩選靶點(diǎn)，例如，蛋白酶體抑制劑是一種新型的抗腫瘤藥物，已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)；基于蛋白磷酸酶PP2A分子模建，目前已設(shè)計(jì)了系列蛋白磷酸酶抑制劑，體內(nèi)外結(jié)果顯示蛋白磷酸酶抑制劑具有廣譜的抗腫瘤效果。此外，唾液酸轉(zhuǎn)移酶抑制劑也能顯著抑制腫瘤生長和抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。這些結(jié)果提示通過進(jìn)一步的研究有望從這些共用反應(yīng)基因中發(fā)現(xiàn)一些