雌激素通過(guò)UCNs-CRHR2系統(tǒng)的心臟保護(hù)作用.pdf

1、心血管疾病的性別差異研究發(fā)現(xiàn)，雌激素具有心肌保護(hù)作用，然而具體機(jī)制尚未完全闡明。當(dāng)前研究提示雌激素通過(guò)多通路介導(dǎo)心肌保護(hù)作用，并通過(guò)內(nèi)源性心肌保護(hù)分子實(shí)現(xiàn)。UCNs-CRHR2系統(tǒng)作為一種內(nèi)源性心肌保護(hù)機(jī)制近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。本研究第一部分發(fā)現(xiàn)雌激素可以上調(diào)心肌細(xì)胞CRHR2表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)UCN的心肌保護(hù)作用。UCN的心肌保護(hù)機(jī)制一直受到廣泛關(guān)注，但具體機(jī)制尚未完全闡明，我們第二部分研究發(fā)現(xiàn)，UCN可以上調(diào)心肌保護(hù)相關(guān)分子SGK表達(dá)，提

2、示UCN上調(diào)心肌細(xì)胞SGK表達(dá)可能是UCN心肌保護(hù)機(jī)制的重要方面。結(jié)合前兩部分研究，我們?cè)诘谌糠盅芯苛舜萍に貙?duì)SGK表達(dá)的調(diào)節(jié)，并探討了雌激素、UCNs-CRHR2、SGK的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)雌激素可以通過(guò)UCNs-CRHR2系統(tǒng)間接上調(diào)心肌細(xì)胞SGK表達(dá)，這可能是雌激素在心肌缺血時(shí)增強(qiáng)心肌對(duì)缺血損傷抵抗力的一種重要分子機(jī)制。
　　 心血管疾病的性別差異研究發(fā)現(xiàn)，雌激素具有心肌保護(hù)作用，然而具體機(jī)制尚未完全闡明。當(dāng)前的研究提示雌激素通

3、過(guò)多通路介導(dǎo)心肌保護(hù)作用，并通過(guò)內(nèi)源性心肌保護(hù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)。UCNs-CRHR2系統(tǒng)作為一種內(nèi)源性心肌保護(hù)機(jī)制近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。雌激素對(duì)UCNs-CRHR2系統(tǒng)的心肌保護(hù)作用是否存在調(diào)節(jié)，尚未見(jiàn)報(bào)道。PI3K-Akt通路是UCNs-CRHR2心肌保護(hù)機(jī)制中非常重要的環(huán)節(jié)。SGK是結(jié)構(gòu)功能與Akt十分相似的蛋白激酶，也能介導(dǎo)PI3K細(xì)胞存活信號(hào)通路，最近還發(fā)現(xiàn)SGK抗心肌細(xì)胞凋亡。SGK是否也參與UCNs-CRHR2系統(tǒng)的心肌保護(hù)機(jī)制，尚未

4、見(jiàn)報(bào)道，本研究的第一部分主要針對(duì)雌激素對(duì)UCNs-CRHR2表達(dá)與功能的影響，探索雌激素的心肌保護(hù)機(jī)制。本課題的第二部分，主要針對(duì)UCN對(duì)SGK表達(dá)的影響，探討UCN的心肌保護(hù)機(jī)制。結(jié)合前兩部分研究，我們?cè)诘谌糠郑饕芯看萍に貙?duì)SGK表達(dá)的影響及相應(yīng)機(jī)制，并探討雌激素、UCNs-CRHR2、SGK之間的關(guān)系，以進(jìn)一步闡述雌激素心肌保護(hù)作用的分子機(jī)制。
　　 主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下：
　　 第一部分雌激素調(diào)節(jié)CRHR2

5、增強(qiáng)Urocortin的心肌保護(hù)作用
　　 1、整體心臟和體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞，通過(guò)real time PCR和western blot法檢測(cè)雌激素對(duì)心臟或心肌細(xì)胞UCN、UCN2、CRHR2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。我們發(fā)現(xiàn)雌激素對(duì)UCN和UCN2沒(méi)有影響，但能顯著增加CRHR2表達(dá)：去卵巢大鼠心臟CRHR2蛋白表達(dá)降低45％(p＜0.05)，而雌激素替代能使CRHR2的表達(dá)恢復(fù)到正常水平；雌激素可呈劑量依賴(lài)地增加心肌細(xì)胞CRH

6、R2蛋白表達(dá)，10nM雌激素能使CRHR2蛋白表達(dá)上調(diào)2倍以上(p＜0.05)，并且其作用通過(guò)ERα實(shí)現(xiàn)。我們還發(fā)現(xiàn)，高濃度UCN(10nM)處理本身能下調(diào)CRHR2表達(dá)(p＜0.05)，而雌激素可以逆轉(zhuǎn)UCN對(duì)CRHR2的下調(diào)作用，使CRHR2表達(dá)維持在較高水平。
　　 2、整體動(dòng)物心肌梗死模型研究雌激素對(duì)UCN心肌缺血保護(hù)作用的影響，心肌損傷指標(biāo)采用梗死區(qū)重量檢測(cè)、血清CK、LDH檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)UCN的心肌保護(hù)作用在去卵巢大

7、鼠顯著減弱，而在雌激素替代處理的去卵巢大鼠，UCN的心肌保護(hù)作用恢復(fù)正常水平。提示，雌激素能維持UCN心肌保護(hù)作用。
　　 3、體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞研究CRHR2特異性阻斷劑和RNA干擾抑制內(nèi)源性CRHR2表達(dá)對(duì)雌激素心肌保護(hù)作用的影響，探討CRHR2在雌激素心肌保護(hù)中的作用。模擬缺血采用低糖無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，置于1％O2-94％N2-5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；心肌損傷指標(biāo)采用MTT細(xì)胞活力測(cè)定、培養(yǎng)上清LDH定量、細(xì)胞蛋白C

8、leaved caspase3檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)CRHR2特異阻斷劑或內(nèi)源性CRHR2表達(dá)干擾都能使雌激素的心肌保護(hù)作用減弱38-56％(p＜0.05)，提示：CRHR2在雌激素心肌保護(hù)中有重要作用。此外，我們?cè)诩?xì)胞上也發(fā)現(xiàn)，雌激素能使UCN心肌保護(hù)作用增強(qiáng)48-83％(p＜0.05)。提示，雌激素能促進(jìn)UCN的心肌保護(hù)作用。
　　 第二部分UCN心肌保護(hù)的機(jī)制：對(duì)SGK的調(diào)節(jié)
　　 1、體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞，通過(guò)real ti

9、me PCR和western blot法檢測(cè)UCN對(duì)SGKmRNA和蛋白表達(dá)的影響。我們發(fā)現(xiàn)UCN劑量依賴(lài)地上調(diào)SGK表達(dá)，10nM UCN能使SGK表達(dá)上調(diào)2倍以上(p＜0.05)；并且CRHR2特異性阻斷劑和MEK阻斷劑能完全阻斷UCN上調(diào)SGK作用。我們還發(fā)現(xiàn)UCN調(diào)節(jié)SGK表達(dá)有顯著的時(shí)間效應(yīng)，UCN作用1h才能使SGK表達(dá)增加，并維持至少24h；而在UCN處理30min時(shí)，磷酸化SGK表達(dá)顯著增加。提示：UCN通過(guò)CRHR2后

10、的MEK-ERK1/2通路上調(diào)心肌細(xì)胞SGK表達(dá)，并且在作用早期對(duì)SGK還有磷酸化調(diào)節(jié)作用。
　　 2、體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞觀察RNA干擾抑制內(nèi)源性SGK表達(dá)對(duì)UCN心肌保護(hù)作用的影響，探討SGK在UCN心肌保護(hù)中的作用。我們發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性SGK表達(dá)干擾可以使UCN心肌保護(hù)作用受到50-60％(p＜0.05)的抑制。提示：SGK參與了UCN心肌保護(hù)機(jī)制。
　　 第三部分雌激素對(duì)SGK表達(dá)的調(diào)節(jié)作用
　　 1、整體心臟和

11、體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞，通過(guò)real time PCR和western blot法檢測(cè)雌激素對(duì)心臟或心肌細(xì)胞SGK mRNA和蛋白表達(dá)的影響。我們發(fā)現(xiàn)，去卵巢大鼠心臟SGK蛋白表達(dá)降低50％(p＜0.05)，而給予雌激素替代處理后，大鼠心臟SGK表達(dá)可以恢復(fù)到正常水平。然而，在培養(yǎng)心肌細(xì)胞上并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)雌激素對(duì)SGK表達(dá)的影響。提示雌激素可能通過(guò)間接作用增加SGK表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)應(yīng)用UCN相比，雌激素和UCN共同孵育心肌細(xì)胞24h，SGK

12、蛋白表達(dá)增加85％(p＜0.05)；雌激素能使缺氧心肌細(xì)胞SGK蛋白表達(dá)增加60％(p＜0.05)，并且CRHR2阻斷劑能完全阻斷這種效應(yīng)。提示：雌激素上調(diào)SGK表達(dá)可能與促進(jìn)UCN作用有關(guān)。
　　 2、在體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞觀察RNA干擾抑制內(nèi)源性SGK表達(dá)對(duì)雌激素心肌保護(hù)作用的影響，探討SGK在雌激素心肌保護(hù)中的作用。我們發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性SGK表達(dá)干擾可以使雌激素心肌保護(hù)作用受到44-66％(p＜0.05)的抑制。提示：SGK可能參