小膠質(zhì)細胞上ATP敏感性鉀通道的表達及其對神經(jīng)炎性反應的調(diào)節(jié).pdf

1、帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運動徐緩、肌僵直以及平衡功能失調(diào)等癥狀，病情呈慢性進行性加重。在55歲以上人群中發(fā)病率約為2﹪，其中95﹪的病例為散發(fā)性。遺傳因素和環(huán)境因素被認為是PD的主要致病因素，其典型病理和生化特征為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性、缺失，Lewy's小體的出現(xiàn)及紋狀體多巴胺(dopamine，DA)含量顯著降低。但DA能神經(jīng)元變性、死

2、亡的機制還未闡明。目前認為氧化應激、興奮性毒性、神經(jīng)炎性反應和線粒體功能障礙等是導致DA能神經(jīng)元死亡的主要機制。特別是腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞活化所介導的神經(jīng)炎性病理反應，是疾病發(fā)生的早期機制之一，并加重其他因素所導致的DA能神經(jīng)元死亡，促進了疾病的發(fā)生發(fā)展。目前，臨床主要應用L-DOPA替代治療或DA受體激動劑改善PD癥狀。但這些藥物并不能阻止疾病的進展，且長期使用易出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等嚴重不良反應。因此，進一步闡明PD的病因與發(fā)病機制、

3、探索有效的PD治療新靶標和治療新藥具有重大意義。包括本實驗室在內(nèi)的國內(nèi)外研究表明，調(diào)節(jié)腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞活化所介導的神經(jīng)炎性病理反應是神經(jīng)保護的重要新策略。 ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitivepotassiumchannel，KATP)是一種耦聯(lián)細胞代謝和電活動、以細胞內(nèi)的ATP/ADP水平為門控因素、非電壓依賴性的特殊鉀離子通道。近年來，包括本實驗室在內(nèi)的研究表明：1)KATP特別是線粒體KATP(mitochondr

4、ialATP-sensitivepotassiumchannel，mito-KATP)是重要的神經(jīng)保護靶標，不僅是急性缺血缺氧、氧化應激等病理因素所致?lián)p傷時的重要內(nèi)源性保護機制，而且在神經(jīng)元受損中、后期的神經(jīng)炎性病理反應以及神經(jīng)元凋亡中也發(fā)揮重要的保護作用；2)KATP與PD的發(fā)生、發(fā)展密切相關，是探討PD發(fā)病機制和研發(fā)治療藥物的新靶標；3)KATP不僅直接對神經(jīng)元發(fā)揮保護作用，而且能通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞功能發(fā)揮對神經(jīng)元

5、的進一步保護作用。新型KATP開放劑埃他卡林(iptakalim，IPT)是我國學者自行設計、合成的脂肪仲胺類小分子化合物，易透過血腦屏障，使得在整體水平上評價KATP開放劑的神經(jīng)保護作用成為可能。本實驗室前期研究顯示，IPT不僅對急慢性腦缺血損傷具有確切的神經(jīng)保護作用，而且對應用多種神經(jīng)毒素如6-羥基多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)、魚藤酮(rotenone，Rot)、N-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methy

6、-4-phenyl-2，3-dihydropyridiniumion，MPP+)等制備的PD整體動物模型和離體細胞模型均具有神經(jīng)保護作用。然而，KATP除了直接保護神經(jīng)元外，還可能通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞功能發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本文旨在從離體和在體水平系統(tǒng)研究KATP對小膠質(zhì)細胞活化的影響，闡明KATP對神經(jīng)炎性反應的調(diào)節(jié)在其神經(jīng)保護作用中的重要作用，也為將IPT發(fā)展為PD治療新藥積累必要的學術(shù)與實驗基礎。 本文工作第一部

7、分首先鑒定了原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細胞上KATP的表達，在此基礎上研究KATP對rotenone誘導的小膠質(zhì)細胞活化的調(diào)節(jié)及其機制；第二部分進一步從在體水平研究KATP對rotenone致PD模型大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞活化介導的神經(jīng)炎性反應的調(diào)節(jié)及其神經(jīng)保護作用。 第一部分小膠質(zhì)細胞上ATP敏感性鉀通道的表達及其對小膠質(zhì)細胞活化的調(diào)節(jié) 目的：研究原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細胞是否表達KATP，在此基礎上進一步研究KATP對roten

8、one誘導的小膠質(zhì)細胞活化的調(diào)節(jié)作用及相關機制。 方法：應用westernblotting、RT-PCR法檢測原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細胞是否表達KATP；從形態(tài)學及免疫熒光細胞化學法檢測小膠質(zhì)細胞的活化；ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量，放射免疫測定法(RIA)檢測PGE2的含量；應用JC-1熒光探針檢測小膠質(zhì)細胞線粒體膜電位；Westernblotting檢測小膠質(zhì)細胞p38/JNKMAPK磷酸化水平。 結(jié)果

9、：1)原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細胞表達KATP，其亞基組成為Kir6.1、SUR2A/2B。2)rotenone(10nM)可顯著誘導小膠質(zhì)細胞活化，形態(tài)學上呈阿米巴樣改變，ED1表達上調(diào)，致炎因子TNF-α和PGE2生成增加；10μMIPT或100μMdiazoxide預處理均能顯著抑制小膠質(zhì)細胞的活化，抑制ED1的表達與TNF-α和PGE2的生成增加。250μM的mito-KATP阻斷劑5-HD可以取消IPT和diazoxide的上述效

10、應。3)rotenone能誘導小膠質(zhì)細胞線粒體膜電位水平下降，以及p38/JNKMAPK磷酸化水平增加；IPT或diazoxide能逆轉(zhuǎn)rotenone的上述作用，5-HD可以取消IPT和diazoxide的上述作用。 結(jié)論：小膠質(zhì)細胞表達KATP，其亞基組成為Kir6.1、SUR2A/R2B；KATP開放能抑制rotenone誘導的小膠質(zhì)細胞活化及致炎因子生成增加，其作用機制與其穩(wěn)定線粒體膜電位及抑制p38/JNK信號通路激活

11、有關。 第二部分ATP敏感性鉀通道對小膠質(zhì)細胞介導的腦內(nèi)神經(jīng)炎性反應的調(diào)節(jié) 目的：研究KATP對rotenone致帕金森病模型大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞活化及神經(jīng)炎性病理反應的影響，進一步探討KATP的神經(jīng)保護作用及機制。 方法：1)動物給藥處理：SD大鼠給予IPT(1.5或3.0mg·kg-1·day-1)或mito-KATP開放劑diazoxide(1.5mg·kg-1·day-1)連續(xù)灌胃三天，自第四天起，于每天I

12、PT或diazoxide灌胃后1h背部皮下注射rotenone(2.5mg·kg-1·day-1)，連續(xù)給藥4周，統(tǒng)計各組大鼠死亡率并進行行為學研究；2)免疫組織化學法檢測腦內(nèi)黑質(zhì)部位DA能神經(jīng)元存活情況(TH染色)，同時檢測黑質(zhì)部位小膠質(zhì)細胞活化情況(OX-42和ED1染色)；3)RT-PCR法檢測腦紋狀體和黑質(zhì)中TNF-α和COX-2mRNA表達水平變化。 結(jié)果：1)單獨給予rotenone組大鼠死亡率明顯增加至40﹪，前爪

13、移動潛伏期均值延長至42s，提示大鼠出現(xiàn)明顯的肌僵直癥狀；不同濃度IPT和diazoxide均可顯著降低大鼠死亡率，緩解肌僵直癥狀。2)rotenone能顯著誘導大鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性死亡(TH陽性細胞數(shù)與對照組相比下降68.1﹪)，并伴隨著小膠質(zhì)細胞活化顯著增加，以及TNF-α和COX-2mRNA表達水平增加。3)不同濃度IPT和diazoxide均可促進DA能神經(jīng)元存活(TH陽性細胞數(shù)與對照組相比分別下降22.2﹪、15.8﹪和1

14、9.7﹪)，并抑制rotenone誘導的小膠質(zhì)細胞活化及TNF-α和COX-2mRNA表達增加。 結(jié)論：系統(tǒng)給予KATP開放劑能顯著緩解rotenone誘導的大鼠帕金森樣癥狀，促進黑質(zhì)DA能神經(jīng)元存活；KATP開放劑的神經(jīng)保護作用與其抑制小膠質(zhì)細胞活化介導的神經(jīng)炎性病理反應密切相關。本文工作的主要創(chuàng)新之處在于： 1.發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細胞表達KATP，其亞基組成為Kir6.1和SUR2A/2B，并系統(tǒng)研究、闡明了K