ATP敏感性鉀通道和帕金森病的相關(guān)性研究.pdf

1、在已有的學(xué)術(shù)基礎(chǔ)上，我們提出KATP和PD的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性的科學(xué)問(wèn)題，本文的研究工作旨在闡明KATP在PD發(fā)病機(jī)制中的地位和作用，探討KATP作為PD藥物研發(fā)靶標(biāo)的可能性。同時(shí)，我們應(yīng)用我國(guó)學(xué)者設(shè)計(jì)、合成的新型KATP開(kāi)放劑埃他卡林(iptakalim，IPT)在PD動(dòng)物模型上開(kāi)展實(shí)驗(yàn)治療學(xué)研究，從實(shí)驗(yàn)治療學(xué)的角度佐證KATP與PD相關(guān)的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)。前期的研究發(fā)現(xiàn)IPT不僅可以透過(guò)血腦屏障，而且在不擴(kuò)張血管和降低血壓的劑量時(shí)，即可對(duì)

2、急性腦缺血損傷產(chǎn)生確切的神經(jīng)保護(hù)作用，使得在整體動(dòng)物模型通過(guò)系統(tǒng)給藥評(píng)價(jià)KATP開(kāi)放劑(KATPchannelopener，KCO)對(duì)PD的實(shí)驗(yàn)治療作用成為可能。 本文工作第一部分應(yīng)用學(xué)術(shù)界公認(rèn)的6-羥基多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)制備的PD模型大鼠，研究KATP在PD模型大鼠相關(guān)腦區(qū)的表達(dá)變化，闡明KATP與PD發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性；第二部分分別應(yīng)用氟哌啶醇(haloperidol)、6-OHDA建立

3、PD大鼠模型，評(píng)價(jià)KCO對(duì)PD模型大鼠的實(shí)驗(yàn)治療學(xué)作用，探討IPT的神經(jīng)保護(hù)作用及其可能機(jī)制，從實(shí)驗(yàn)治療學(xué)的角度佐證KATP與PD相關(guān)的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，為將IPT發(fā)展成為PD治療新藥積累必要的學(xué)術(shù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第一部分KATP在6-OHDA制備的PD模型大鼠相關(guān)腦區(qū)的表達(dá)變化 目的：研究6-OHDA制備的PD模型大鼠皮層、海馬及紋狀體KATP表達(dá)變化，闡明KATP和PD發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。 方法：1)6-OHDA制備P

4、D模型大鼠：SD大鼠右側(cè)黑質(zhì)立體定位注射6-OHDA8μg·μL-1，另取數(shù)只大鼠僅注射溶劑，作為偽手術(shù)組。大鼠飼養(yǎng)21天后，頸部皮下給予apomorphine(0.05mg·kg-1)誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為，記錄30min，大于7圈/分的大鼠在7天后繼續(xù)重復(fù)篩選，兩次均符合標(biāo)準(zhǔn)的大鼠即為成功的PD大鼠模型；2)KATP各亞基mRNA轉(zhuǎn)錄變化：處死PD模型大鼠，快速冰上取腦，分離皮層、海馬及紋狀體，提取mRNA進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，觀察PD模型大

5、鼠皮層、海馬及紋狀體KATP各種亞基的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的改變；3)KATP各亞基蛋白表達(dá)變化：灌注PD模型大鼠，取腦制作蠟塊，分別切取皮層、紋狀體和海馬的石蠟切片，利用特異性的KATP抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，觀察PD模型大鼠皮層、海馬及紋狀體KATP蛋白表達(dá)的改變。 結(jié)果：1)RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：PD模型大鼠患側(cè)皮層的Kir6.2和SUR2mRNA水平、患側(cè)海馬的Kir6.1和Kir6.2mRNA水平、患側(cè)紋狀體的Kir

6、6.1、Kir6.2和SUR1mRNA水平較健側(cè)及偽手術(shù)組均顯著升高。2)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：PD模型大鼠患側(cè)皮層的Kir6.2和SUR2蛋白表達(dá)水平、患側(cè)海馬的Kir6.1和Kir6.2蛋白表達(dá)水平、患側(cè)紋狀體的Kir6.1、Kir6.2和SUR1蛋白表達(dá)水平較健側(cè)及偽手術(shù)組均顯著升高。 結(jié)論：PD模型大鼠患側(cè)相關(guān)腦區(qū)的KATP某些亞基較健側(cè)表達(dá)顯著上調(diào)，表明KATP可能與PD的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。 第二部分新型KA

7、TP開(kāi)放劑埃他卡林對(duì)PD模型大鼠實(shí)驗(yàn)治療學(xué)研究 一、埃他卡林對(duì)haloperidol建立的PD模型大鼠的實(shí)驗(yàn)治療作用目的：研究新型KATP開(kāi)放劑IPT對(duì)haloperidol誘導(dǎo)的大鼠帕金森樣癥狀的實(shí)驗(yàn)治療作用，初步探討IPT作為PD治療藥物的可能性。 方法：1)應(yīng)用haloperidol建立PD行為學(xué)模型：大鼠皮下給予haloperidol0.225mg·kg-1，用于研究IPT對(duì)catalepsy癥狀的改善作用；大鼠

8、皮下給予haloperidol0.1mg·kg-1，用于研究IPT對(duì)hypolocomotion改善作用，包括walkingtime、rearingandgrooming；2)動(dòng)物分組如下：空白對(duì)照組(給予相應(yīng)體積的溶劑)，，haloperidol，haloperidol+L-DOPA(100mg·kg-1，ip)，haloperidol+IPT(0.025mg·kg-1，iv)，haloperidol+IPT(0.05mg·kg-1，

9、iv)，haloperidol+IPT(0.125mg·kg-1，iv)，haloperidol+IPT(0.25mg·kg-1，iv)，haloperidol+IPT(0.5mg·kg-1，iv)，haloperidol+IPT(0.25mg·kg-1，iv)+L-DOPA(100mg·kg-1，ip)。在大鼠皮下注射haloperidol30min后，分別給予各組大鼠相應(yīng)藥物，通過(guò)計(jì)算大鼠前爪運(yùn)動(dòng)潛伏時(shí)間、行走時(shí)間、直立及梳洗次數(shù)，

10、觀察IPT對(duì)大鼠全身僵硬癥狀和自發(fā)性活動(dòng)的影響。 結(jié)果：1)Catalepsy實(shí)驗(yàn)表明，在給予治療藥物30、60min后，IPT0.125、0.25、0.5mg·kg-1可以改善haloperidol誘導(dǎo)的大鼠全身僵硬癥狀。2)Walkingtime實(shí)驗(yàn)表明，在給予治療藥物30、60min后，IPT0.125、0.25、0.5mg·kg-1在30、60min后，均可增加haloperidol誘導(dǎo)的大鼠自發(fā)性活動(dòng)次數(shù)的減少癥狀。3

11、)Rearingandgrooming實(shí)驗(yàn)表明，在給予治療藥物30min后，IPT0.125、0.25、0.5mg·kg-1可緩解haloperidol誘導(dǎo)的大鼠的直立和梳洗次數(shù)減少癥狀。 結(jié)論：IPT緩解haloperidol引起的大鼠全身僵硬和自發(fā)性活動(dòng)的減少，對(duì)PD行為學(xué)模型大鼠的帕金森樣癥狀有顯著的改善作用。 二、埃他卡林對(duì)6-OHDA制備的PD模型大鼠的實(shí)驗(yàn)治療作用 目的：研究IPT對(duì)6-OHDA制備的

12、PD模型大鼠實(shí)驗(yàn)治療學(xué)作用及相關(guān)機(jī)制。 方法：1)6-OHDA制備PD模型大鼠：SD大鼠右側(cè)黑質(zhì)立體定位注射6-OHDA8μg·μL-1，另取數(shù)只大鼠僅注射溶劑，作為偽手術(shù)組。飼養(yǎng)21天后，頸部皮下給予apomorphine(0.05mg·kg-1)誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為，篩選成功的PD大鼠模型；2)成功PD模型大鼠分為5組進(jìn)行給藥治療：IPT治療組(0.75mg·kg-1·day-1，1.5mg·kg-1·day-1，3.0mg·kg-

13、1·day-1)，L-DOPA治療組(10mg·kg-1·day-1)，均每天灌胃給藥一次，持續(xù)21天；模型組、偽手術(shù)組大鼠均每天灌胃相應(yīng)體積生理鹽水，持續(xù)21天；3)在給藥治療第7、14及21天，各組大鼠均進(jìn)行apomorphine誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)；4)第二周治療結(jié)束時(shí)，各組大鼠進(jìn)行立體定位手術(shù)在大鼠雙側(cè)紋狀體埋置套管，術(shù)后恢復(fù)6天，相應(yīng)行為學(xué)測(cè)試后，進(jìn)行微透析實(shí)驗(yàn)，收集生物樣品，HPLC檢測(cè)微透析液中的神經(jīng)遞質(zhì)水平；5

14、)微透析實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，灌注大鼠，制備黑質(zhì)冰凍切片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法研究黑質(zhì)腦區(qū)DA神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的變化；6)原代培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行[3H]-D,L-Glu再攝取實(shí)驗(yàn)研究IPT對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞GluTs功能改變的影響。 結(jié)果：1)L-DOPA10mg·kg-1·day-1，IPT3.0mg·kg-1·day-1在治療三周內(nèi)均顯著改善6-OHDAPD模型大鼠的apomorphine誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為

15、。2)IPT(1.5mg·kg-1·day-1，3.0mg·kg-1·day-1)在降低健側(cè)紋狀體細(xì)胞外DA水平的同時(shí)，能夠增加患側(cè)紋狀體DA水平；L-DOPA和IPT(O.75mg·kg-1·day-1，1.5mg·kg-1·day-1，3.0mg·kg-1·day-1)對(duì)PD模型大鼠健側(cè)紋狀體細(xì)胞外Glu水平?jīng)]有影響，但是均可以顯著降低患側(cè)紋狀體的細(xì)胞外Glu水平。3)模型組大鼠毀損側(cè)SN的TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較健側(cè)及偽手術(shù)組大鼠顯著減少

16、，IPT治療組大鼠的毀損側(cè)、健側(cè)與模型組大鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)沒(méi)有顯著性差異；模型組大鼠毀損側(cè)SN的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較健側(cè)及偽手術(shù)組大鼠顯著增加，IPT治療組大鼠毀損側(cè)較模型組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少，而治療組大鼠健側(cè)的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組及偽手術(shù)組大鼠健側(cè)沒(méi)有顯著改變。4)6-OHDA50μmol·L-1顯著抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取功能，IPT1μmol·L-1，10μmol·L-1及pinacidil10μmol·L-

17、1均能夠逆轉(zhuǎn)6-OHDA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取功能的抑制作用，glibenclamide能夠阻斷IPT及pinacidil的作用。 結(jié)論：IPT顯著改善6-OHDA所致PD模型大鼠的行為障礙；IPT通過(guò)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)包括抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能而實(shí)現(xiàn)對(duì)黑質(zhì)-紋狀體通路中神經(jīng)遞質(zhì)水平的雙向調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。 綜上所述，本文工作的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于1.提出KATP和PD