黑色素瘤相關(guān)抗原MAGe-A9對(duì)p53轉(zhuǎn)錄活性及穩(wěn)定性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 野生型p53在監(jiān)控細(xì)胞基因組DNA的完整性上發(fā)揮著“基因組衛(wèi)士”的作用。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的表達(dá)水平很低。細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)，p53轉(zhuǎn)錄被激活并誘導(dǎo)其下游靶基因表達(dá)，從而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期、促凋亡的生物學(xué)作用。最近的研究表明，黑色素瘤相關(guān)抗原MAGE-A亞家族的一些成員與p53之間可發(fā)生相互作用，MAGE-A可抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性，并可與MDM2結(jié)合，促進(jìn)p53泛素化和降解，從而阻礙了腫瘤抑制因子p53功

2、能的發(fā)揮。本課題旨在研究MAGE-A亞家族中MAGE-A9對(duì)p53轉(zhuǎn)錄活性及穩(wěn)定性的影響，進(jìn)而了解MAGE-A9在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能的信號(hào)通路及作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.利用基因轉(zhuǎn)染、RT-PCR、WesternBlot、熒光素酶報(bào)告基因分析等方法檢測(cè)外源性MAGE-A9對(duì)p53靶基因p21WAF1表達(dá)的影響。
　　 2.通過(guò)細(xì)胞克隆形成以及MTT實(shí)驗(yàn)分析基因轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞的增殖活性。<

3、br>　　 3.利用基因轉(zhuǎn)染、RT-PCR、WesternBlot研究MAGE-A9對(duì)p53表達(dá)的影響。
　　 4.采用放線菌酮蛋白合成抑制實(shí)驗(yàn)，分析不同轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231細(xì)胞中p53蛋白在放線菌酮作用不同時(shí)間后的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.RT-PCR分析結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體組相比，轉(zhuǎn)染p53基因可以使MDA-MB-231細(xì)胞中p21WAF1mRNA表達(dá)水平增加(P＜0.05);共同轉(zhuǎn)染p5

4、3基因和MAGE-A9基因后，p21WAF1mRNA表達(dá)水平均明顯低于單獨(dú)轉(zhuǎn)染p53基因時(shí)的表達(dá)水平(P＜0.05);單獨(dú)轉(zhuǎn)染MAGE-A9基因后，MDA-MB-231細(xì)胞中p21WAF1mRNA表達(dá)水平與轉(zhuǎn)染空載體組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 2.WesternBlot分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染p53基因后，MDA-MB-231細(xì)胞中p21WAF1蛋白表達(dá)水平明顯高于p53未轉(zhuǎn)染組(P＜0.05);與單獨(dú)轉(zhuǎn)染p53組相比，共轉(zhuǎn)

5、p53和MAGE-A9質(zhì)粒組MDA-MB-231細(xì)胞中p21WAF1蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。
　　 3.熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示，對(duì)照組MDA-MB-231細(xì)胞的熒光素酶活性為1.00±0.00;在單獨(dú)轉(zhuǎn)染25ngp53質(zhì)粒組MDA-MB-231細(xì)胞，p21WAF1啟動(dòng)子介導(dǎo)的熒光素酶活性為58.56±3.47，與對(duì)照組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);共轉(zhuǎn)染25ngp53質(zhì)粒和逐漸增加量MA

6、GE-A9質(zhì)粒(100ng、200ng、400ng)后，MDA-MB-231細(xì)胞中p21WAF1啟動(dòng)子介導(dǎo)的熒光素酶活性分別為49.40±5.74、35.93±2.27、22.48±4.98，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染p53組相比明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染空載體組，G418抗性的細(xì)胞克隆數(shù)為143.50±11.39;單獨(dú)轉(zhuǎn)染p53質(zhì)粒組，G418抗性的細(xì)胞

7、克隆數(shù)為53.25±6.08，與空載體對(duì)照組相比顯著降低(P＜0.05);共同轉(zhuǎn)染p53質(zhì)粒和MAGE-A9質(zhì)粒組MDA-MB-231細(xì)胞，G418抗性的細(xì)胞克隆數(shù)為115.50±7.94，與單獨(dú)p53質(zhì)粒組相比顯著增加(P＜0.05);單獨(dú)轉(zhuǎn)染MAGE-A9質(zhì)粒組，G418抗性的MDA-MB-231細(xì)胞克隆數(shù)為150.75±9.29，與空載體組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 5.MTT法分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染基因后的

8、MDA-MB-231細(xì)胞接種96孔板24、48小時(shí)，空載體組、單獨(dú)轉(zhuǎn)染p53質(zhì)粒組、共同轉(zhuǎn)染p53和MAGE-A9質(zhì)粒組、單獨(dú)轉(zhuǎn)染MAGE-A9質(zhì)粒組MDA-MB-231細(xì)胞的相對(duì)增殖率分別為135.18％和337.23％、138.27％和228.89％、139.44％和291.51％、142.62％和330.71％。接種24小時(shí)后，各組間細(xì)胞的相對(duì)增殖率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。接種48小時(shí)后，單獨(dú)轉(zhuǎn)染p53質(zhì)粒組以及共轉(zhuǎn)p5

9、3和MAGE-A9質(zhì)粒組細(xì)胞的相對(duì)增殖率降低(P＜0.05);單獨(dú)轉(zhuǎn)染p53質(zhì)粒組細(xì)胞的相對(duì)增殖率明顯低于共轉(zhuǎn)p53和MAGE-A9質(zhì)粒組（P＜0.05）。
　　 6.在轉(zhuǎn)錄水平上MAGE-A9對(duì)p53表達(dá)影響的分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空載體組、單獨(dú)轉(zhuǎn)染0.5μgp53質(zhì)粒組、共同轉(zhuǎn)染0.5μgp53和0.5μgMAGE-A9質(zhì)粒組、共同轉(zhuǎn)染0.5μgp53和1.0μgMAGE-A9質(zhì)粒組MDA-MB-231細(xì)胞中p53與GAPDH條

10、帶的灰度值比分別為0.492±0.003、0.723±0.026、0.709±0.014、0.712±0.014。各實(shí)驗(yàn)組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 7.在翻譯水平上MAGE-A9對(duì)p53穩(wěn)定性影響的分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空載體組、單獨(dú)轉(zhuǎn)染0.5μgp53質(zhì)粒組、共同轉(zhuǎn)染0.5μgp53和0.5μgMAGE-A9質(zhì)粒組、共同轉(zhuǎn)染0.5μgp53和1.0μgMAGE-A9質(zhì)粒組MDA-MB-231細(xì)胞中p53與GAP

11、DH條帶的灰度值比分別為0.747±0.011、0.961±0.027、0.677±0.021、0.607±0.023。各組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 8.放線菌酮蛋白合成抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)轉(zhuǎn)染p53質(zhì)粒組，100μg/mL放線菌酮作用0、1、2、4、6小時(shí)后，MDA-MB-231細(xì)胞中p53與GAPDH蛋白條帶的灰度值比分別為0.918±0.014、0.777±0.032、0.607±0.059、0.3

12、83±0.032、0.208±0.017;而共同轉(zhuǎn)染p53質(zhì)粒和MAGE-A9質(zhì)粒組，100μg/mL放線菌酮作用0、1、2、4、6小時(shí)后，p53與GAPDH蛋白條帶的灰度值比分別為0.890±0.070、0.495±0.039、0.268±0.032、0.165±0.017、0.084±0.018。兩實(shí)驗(yàn)組中p53蛋白的表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 黑色素瘤相關(guān)抗原MA