Fra-1與乳腺癌的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、Fra-1是轉(zhuǎn)錄因子AP-1家族中的一員，最近研究發(fā)現(xiàn)Fra-1過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲。在鼠成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Fra-1可導(dǎo)致貼壁非依賴性生長(zhǎng)以及惡性轉(zhuǎn)化。在多種腫瘤如乳腺、肺、結(jié)腸以及轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中檢測(cè)到Fra-1 mRNA及蛋白水平的高表達(dá)。然而有關(guān)Fra-1在良、惡性乳腺組織中的表達(dá)、Fra-1是否增加腫瘤的侵襲和遷移，F(xiàn)ra-1調(diào)控哪些侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因鮮有報(bào)道。 本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Fra-1在良、惡性乳

2、腺腫瘤中的表達(dá)差別，發(fā)現(xiàn)良、惡性乳腺腫瘤的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都存在Fra-1表達(dá)，但Fra-1在惡性腫瘤細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)明顯高于良性腫瘤，提示與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明Fra-1在惡性腫瘤細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后指標(biāo)ER、PR和HER2的表達(dá)均無(wú)相關(guān)性。RT-PCR及Western Blot分析結(jié)果證實(shí)，高侵襲性的乳腺癌細(xì)胞中Fra-1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平增高，低侵襲性的乳腺癌細(xì)胞中Fra-1 mRNA和蛋白則低表達(dá)或不表

3、達(dá)。 隨后，構(gòu)建了Fra-1真核表達(dá)載體，在低侵襲性的MCF-7乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Fra-1，通過(guò)集落形成實(shí)驗(yàn)、黏附實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)觀察Fra-1對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響。結(jié)果顯示Fra-1可增加乳腺癌細(xì)胞的增殖、黏附和遷移能力，RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ra-1對(duì)AP-1部分家族成員有調(diào)控作用。 為進(jìn)一步研究Fra-1參與腫瘤侵襲遷移的機(jī)制，我們構(gòu)建了pGL3-MMP-9啟動(dòng)子報(bào)告載體，分析Fra-1對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因

4、MMP-9啟動(dòng)子活性的影響。雙熒光素報(bào)告載體分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ra-1對(duì)MMP-9的啟動(dòng)子活性無(wú)明顯影響。重新對(duì)MMP-9啟動(dòng)子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)MMP-9啟動(dòng)子上AP-1反應(yīng)元件(TRE)與轉(zhuǎn)錄因子Stat3的反應(yīng)元件(SIE)相毗鄰。再次應(yīng)用雙熒光素報(bào)告載體分析，發(fā)現(xiàn)Fra-1與Stat3協(xié)同參與了對(duì)MMP-9的啟動(dòng)子的調(diào)控，結(jié)果表明Fra-1協(xié)同Stat3明顯增加了MMP-9的啟動(dòng)子活性。采用Fra-1、Stat3C共轉(zhuǎn)染后明

5、膠酶譜實(shí)驗(yàn)證實(shí)MMP-9的酶活性顯著增高。通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)Stat3與Fra-1/c-Jun存在相互作用；寡核苷酸pull down實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Stat3、 Fra-1/c-Jun與含TRE和SIE的MMP-9啟動(dòng)子序列在體外存在直接的相互作用。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合PCR(ChIP-PCR)方法進(jìn)一步確證，Stat3和Fra-1與含TRE元件及SIE元件的MMP-9啟動(dòng)子序列的原位結(jié)合。 綜上所述：(1)Fra-1在乳腺惡性