利用T7噬菌體cDNA文庫篩選登革2型病毒與白紋伊蚊相互作用基因.pdf

1、目的：
　　 1.從白紋伊蚊體內(nèi)提取總RNA，分離純化出mRNA，反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA并將其轉(zhuǎn)入T7噬菌體，利用T7噬菌體構建白紋伊蚊cDNA文庫，并鑒定文庫是否符合文庫構建標準。
　　 2.培養(yǎng)C6/36細胞，利用C6/36細胞擴增登革2型病毒，并將登革2型病毒進行純化，測量病毒滴度，檢測純化后病毒與登革2型特異性抗體的結合能力。
　　 3.利用上述構建的白紋伊蚊T7噬菌體cDNA文庫與分離純化的登革2型病毒，

2、通過蛋白分子雜交的方法，篩選出白紋伊蚊與登革2型病毒相互作用的相關因子的基因，并將篩選出的基因進行生物信息學分析。
　　 方法：
　　 1.利用T7噬菌體構建白紋伊蚊cDNA文庫：首先分離純化出白紋伊蚊的mRNA;所得的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，在雙鏈cDNA末端加上定向的EcoRⅠ/HindⅢ接頭使其兩端分別帶EcoRⅠ和HindⅢ黏性末端；然后用MiniColumn純化收集300bp以上的雙鏈cDNA片段，連

3、接于T7Select10-3b載體；經(jīng)體外包裝后，以BLT5403為受主菌株構建T7噬菌體展示cDNA文庫。對從原始文庫中隨機挑取的50個噬菌斑進行PCR鑒定重組率。將構建成功的cDNA文庫進行擴增，濃縮并保存。
　　 2.純化登革2型病毒：采用登革2型病毒的中間受主C6/36細胞來增殖病毒。通過分析登革2型病毒對C6/36細胞感染和復制的情況，確定收獲高滴度病毒的最佳時間段，然后通過大量的感染來增殖病毒。獲得大量登革2型病毒液

4、，然后反復凍融，使增殖的登革病毒從感染的C6/36細胞中釋放出來。采用PEG-8000進行濃縮，將濃縮病毒重懸，用30％的蔗糖墊底進行超速離心，將病毒純化。將純化的病毒進行滴度測試和病毒感染性檢測。
　　 3.篩選與登革2型病毒相互作用的白紋伊蚊作用因子：應用噬菌體展示技術。以純化的登革2型病毒作為靶分子，通過蛋白分子雜交的方法，對T7噬菌體白紋伊蚊cDNA文庫進行多輪生物篩選，對篩選到的陽性克隆進行測序，將測序得到的DNA序列

5、進行分析及同源性搜索
　　 結果：
　　 1.本文所構建的白紋伊蚊cDNA文庫在重組率、文庫庫容量和文庫的均一性方面均符合文庫構建的基本要求。此文庫的庫容量經(jīng)測定為1.7×107pfu/mL，擴增后文庫滴度為2.5×1013pfu/mL，濃縮后的文庫滴度為2.13×1015pfu/mL。重組率為95％以上；陽性克隆片段長度分布在200bp至2000bp，其中有90％的插入片段大于300bp。均符合構建文庫的庫容量在1.0

6、×106以上，構建文庫的庫容量在90％以上且大于300bp，文庫的均一的標準。本文成功構建的白紋伊蚊cDNA文庫，為后續(xù)的蟲媒病毒相關受體的研究提供了充足的材料。
　　 2.C6/36細胞在感染病毒5天后出現(xiàn)細胞皺縮、變形，繼而出現(xiàn)多細胞融合形成的巨細胞，7-8天左右出現(xiàn)大量細胞破碎。在細胞發(fā)生融合時，將其于-20℃凍存。獲得大量的登革病毒液后，將所得的病毒液純化，純化后的登革2型病毒的滴度為TCID50=10-3.875。純化

7、的登革2型病毒通過SDS-PAGE分析，加入登革一抗可以看到明顯的條帶。所得到的登革2型純化病毒的滴度和SDS-PAGE的結果分析均表示其具有很強的感染能力，這可以為相關實驗提供足夠感染能力的病毒。
　　 3.通過將所構建的白紋伊蚊cDNA文庫和所純化的登革2型病毒相互作用，多次淘洗得到2個陽性克隆。將其測序后，其測序結果在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫中進行同源性搜索和比對(BLAST)，發(fā)現(xiàn)這兩個陽性克隆分別與埃及伊蚊的唾液腺上的基

8、因序列和埃及伊蚊的mRNA降解蛋白質(zhì)的部分基因的序列具有很高的同源性，同源性分別達到81％和90％。因埃及伊蚊與白紋伊蚊的同源性很高，同為傳播登革病毒的重要蚊蟲媒介。因此，此結果可以確定是能與登革2型病毒相互作用的蛋白，其中一段基因位于蚊蟲唾液腺上，這與許多研究蚊蟲登革病毒受體的工作人員得到的結果一致，但是重新從分子生物學的角度得到了有力證據(jù)，以前的研究大部分停留在蛋白的階段。同時也發(fā)現(xiàn)mRNA降解蛋白質(zhì)(NMD)與白紋伊蚊感染傳播登革

9、2型病毒有可能存在一定的關系。
　　 結論：
　　 1.本文構建了白紋伊蚊T7噬菌體展示cDNA文庫，構建的文庫滿足生物分子學文庫的基本標準，可以用于篩選白紋伊蚊與相關蚊蟲病毒相互作用基因的研究。同時，為后續(xù)研究白紋伊蚊與登革病毒相互作用機制和蚊蟲傳播蟲媒病毒的相關研究奠定了基礎，提供了充足的研究材料。而且從分子生物學的角度來看，這對蟲媒病毒的傳播有了更深刻地研究。
　　 2.本文用此方法純化的登革2型病毒的滴度

10、符合后續(xù)篩選要求,將純化的登革2型病毒進行病毒滴度測試，此病毒滴度的登革2型病毒的感染力基本符合要求；通過用SDS-PAGE的方法分析此方法純化的登革2型病毒，可以看到在目的條帶處有明顯的條帶，說明所純化的登革2型病毒具有感染力。
　　 3.本文使用的T7噬菌體展示技術是篩選相互作用因子基因的一種簡單、快速和有效的手段。篩選到的相互作用因子的基因為進一步探討白紋伊蚊與登革2型病毒感染機制提供了重要的依據(jù)；對媒介蚊蟲對登革病毒易感