基于抗真菌新靶標(biāo)分泌型天冬氨酸蛋白酶和N-肉豆莞蔻酰基轉(zhuǎn)移酶發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化新型小分子抑制劑.pdf

1、真菌感染分為淺表性感染和深部感染。淺表性感染是傳播性多發(fā)病，經(jīng)常反復(fù)發(fā)作，是令患者頭痛的頑疾;深部感染近年來(lái)發(fā)病率逐年增高，嚴(yán)重影響和威脅人類生命健康，已成為免疫缺陷患者(HIV感染者、癌癥患者等)致死的重要因素。其中，白念珠菌在侵入性真菌感染中的致死率達(dá)20％～40％，且耐藥性念珠菌不斷出現(xiàn)，給抗真菌治療帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。目前，針對(duì)現(xiàn)有抗真菌靶標(biāo)的臨床藥物均存在一定缺陷，如作用于真菌細(xì)胞膜脂質(zhì)的兩性霉素B存在嚴(yán)重的腎毒性，作用于羊毛甾醇

2、14α-去甲基化酶的唑類藥物耐藥性嚴(yán)重等。因此，迫切需要尋找和發(fā)現(xiàn)具有全新作用機(jī)制、抗菌譜廣、無(wú)交叉耐藥性的新型抗真菌先導(dǎo)化合物。
　　本論文基于抗真菌新靶點(diǎn)分泌型天冬氨酸蛋白酶2(Secreted aspartic protease2，Sap2)，建立Sap2抑制劑篩選模型，通過(guò)虛擬篩選發(fā)現(xiàn)了全新結(jié)構(gòu)類型Sap2小分子抑制劑，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)展了優(yōu)化設(shè)計(jì)、構(gòu)效關(guān)系及體內(nèi)外抗真菌活性研究。此外，還針對(duì)抗真菌新靶標(biāo)N-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶

3、(N-Myristoyltransferase，NMT)，對(duì)其抑制劑FTR1335開(kāi)展了結(jié)構(gòu)優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系研究。
　　一、新型Sap2抑制劑的虛擬篩選和生物活性研究
　　Sap2活性位點(diǎn)空腔大、柔性強(qiáng)，合理設(shè)計(jì)小分子抑制劑具有較大的挑戰(zhàn)性。采用GOLD軟件作為篩選工具，通過(guò)基于分子對(duì)接的虛擬篩選從Specs數(shù)據(jù)庫(kù)中得到45個(gè)候選化合物。其中，18個(gè)化合物在100μM時(shí)的酶抑制率大于40％?；衔顰8、A12、A39和A40等

4、表現(xiàn)出中等或以上強(qiáng)度的抑酶活性，其中化合物A40抑酶活性最佳(IC50=13.78μM)。通過(guò)分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬，初步闡明了活性化合物的作用模式，發(fā)現(xiàn)它們主要通過(guò)氫鍵、疏水和π-π相互作用與Sap2結(jié)合。所發(fā)現(xiàn)的Sap2抑制劑在體外不具有抗真菌活性，與毒力因子的作用機(jī)制相吻合。在線蟲真菌感染模型活性測(cè)試中，化合物A12和A40顯示了優(yōu)秀的體內(nèi)抗真菌活性，可作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行優(yōu)化研究。
　　二、新型噻唑酮類Sap2抑制劑的設(shè)計(jì)

5、、合成和生物活性研究
　　化合物A40是前期基于虛擬篩選發(fā)現(xiàn)的新型噻唑酮類Sap2抑制劑，對(duì)其進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化，共設(shè)計(jì)合成71個(gè)全新結(jié)構(gòu)的噻唑酮類衍生物。構(gòu)效關(guān)系研究表明，位于S1'和S1兩個(gè)疏水口袋的A、B環(huán)具有良好的骨架構(gòu)成和支撐作用，且苯環(huán)上為4-甲基取代時(shí)活性表現(xiàn)最佳;C環(huán)羧基側(cè)鏈?zhǔn)前l(fā)揮活性作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，增加了化合物與靶酶的氫鍵相互作用，使抑酶活性得到顯著提高。其中，部分化合物具有較好的抑酶活性(如D7、D8、D12、D1

6、4、D19和D22，IC50值均小于5μM)?；衔顲2和D8對(duì)線蟲真菌感染模型具有較好的保護(hù)作用，與氟康唑效果相當(dāng)。尤其是化合物D8的抑酶活性達(dá)到了nM級(jí)(IC50=0.86μM)，并在系統(tǒng)性白念菌感染的小鼠模型中有效?；衔顳8與氟康唑聯(lián)合用藥后，對(duì)氟康唑耐藥菌感染的小鼠亦有較好的保護(hù)作用，為克服耐藥菌感染提供了一種新策略。
　　三、新型三氨基三嗪類S印2抑制劑的設(shè)計(jì)、合成和生物活性研究
　　化合物A12是基于虛擬篩選發(fā)

7、現(xiàn)的新型三氨基三嗪類Sap2抑制劑，對(duì)其進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化，共設(shè)計(jì)合成了31個(gè)全新結(jié)構(gòu)的衍生物。構(gòu)效關(guān)系研究表明，4位苯環(huán)部分引入取代基對(duì)化合物抑酶活性有一定影響;而6位側(cè)鏈引入關(guān)鍵氫鍵結(jié)合基團(tuán)(-OCH2COOH)，化合物抑酶活性顯著增強(qiáng)，設(shè)計(jì)思想得到了分子對(duì)接驗(yàn)證。其中，化合物I30抑酶活性最佳(IC50=9.15μM)，其對(duì)線蟲真菌感染模型亦表現(xiàn)出良好的保護(hù)作用。
　　四、新型吡唑酮類Sap2抑制劑發(fā)現(xiàn)、設(shè)計(jì)、合成和生物活性研究

8、
　　通過(guò)對(duì)ChemDiv數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Sap2抑制劑的虛擬篩選，得到了50個(gè)候選分子，其中8個(gè)化合物在100μM時(shí)的酶抑制率大于40％。化合物J16、J28、J29和J41具有中等強(qiáng)度的抑酶活性，其中化合物J29抑酶活性最佳(IC50=5.04μM)。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合成了30個(gè)全新結(jié)構(gòu)的吡唑酮類衍生物。構(gòu)效關(guān)系研究顯示，A環(huán)引入不同取代基對(duì)化合物的抑酶活性有一定影響，而B環(huán)羧基側(cè)鏈的引入是保持其活性作用的關(guān)鍵。分子對(duì)接結(jié)果表明，高

9、活性化合物（化合物K13和K20）在S3口袋形成了新的氫鍵相互作用，這一發(fā)現(xiàn)為吡唑酮類Sap2抑制劑的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系探討提供了新的思路。
　　五、新型苯并噻唑類N-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶抑制劑的設(shè)計(jì)、合成和抗真菌活性研究
　　N-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶可以催化肉豆蔻酰基從肉豆蔻酰CoA轉(zhuǎn)移至真核細(xì)胞蛋白或病毒蛋白N端的甘氨酸上，進(jìn)而形成N-肉豆蔻酰化蛋白。NMT已被確證是白念珠菌和新型隱球菌等臨床重要致病真菌繁殖和生存所必須的酶?；?/p>

10、合物FTR1335是目前報(bào)道的抑酶活性較好的一類NMT抑制劑。
　　本論文進(jìn)行化合物FTR1335的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系探討。通過(guò)骨架躍遷設(shè)計(jì)合成四種結(jié)構(gòu)類型共25個(gè)衍生物。其中，化合物N1(MIC80=1μg/mL)、N2(MIC80=1μg/mL)、O1(MIC80=0.125μg/mL)對(duì)石膏狀小孢子菌的活性均優(yōu)于氟康唑(MIC80=32μg/mL)?；衔風(fēng)9和L14在抗真菌活性、抗真菌譜和化合物溶解性方面均得到良好改善，且

11、化合物L(fēng)14對(duì)線蟲真菌感染模型效果明顯，值得進(jìn)行深入研究。
　　綜上，本論文針對(duì)抗真菌新靶標(biāo)Sap2和NMT開(kāi)展了新型抑制劑研究。通過(guò)基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，首次發(fā)現(xiàn)三種全新結(jié)構(gòu)類型的Sap2抑制劑，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)、構(gòu)效關(guān)系和體內(nèi)外抗真菌活性研究，共得到131個(gè)新型Sap2抑制劑，部分化合物具有較高抑酶活性，并且在線蟲或小鼠模型中顯示了優(yōu)秀的體內(nèi)抗真菌活性。這些新型Sap2小分子抑制劑可作為先導(dǎo)化合物研發(fā)新一代抗真菌藥物。通過(guò)對(duì)N