MDM4三個(gè)新轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)及其與膠質(zhì)瘤相關(guān)性的初步研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最為常見的神經(jīng)上皮腫瘤，雖然近年來，影像學(xué)診斷，顯微外科手術(shù)，化療，放療等方面都有不同程度的進(jìn)步，但在腫瘤的預(yù)后上卻沒有顯著的延長。因此如何提高腦膠質(zhì)瘤的綜合治療療效一直是神經(jīng)外科領(lǐng)域的難題。近幾年來，關(guān)于腫瘤分子生物學(xué)方面的研究不斷增多，因而如何闡述膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找特異性診斷和治療的靶標(biāo)則成為目前膠質(zhì)瘤研究的熱點(diǎn)。
　　 可變剪接機(jī)制是基因轉(zhuǎn)錄后一項(xiàng)精密而復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，與人類遺傳病有著緊密的聯(lián)系

2、，更被認(rèn)為是癌癥表達(dá)的天然來源。針對(duì)腫瘤mRNA的可變剪接研究在針對(duì)腫瘤的及時(shí)診斷和治療均有非常重要的作用。MDM4基因(Murinedoubleminute4，鼠雙微基因4)是我科在前期工作中利用基因芯片技術(shù)篩選出的與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后和化療敏感性相關(guān)的一個(gè)基因。該基因是p53上游重要的調(diào)控因子，但在腫瘤發(fā)生中是致癌基因還是抑癌基因的作用目前仍尚存爭議。目前考慮MDM4基因的復(fù)雜功能和存在的爭議可能與MDM4剪切變異體的存在有關(guān)；雖然近幾

3、年來，MDM4基因在膠質(zhì)瘤中的功能研究不斷深入，但是在膠質(zhì)瘤中的剪接現(xiàn)象研究卻鮮有報(bào)道。鑒于該基因在膠質(zhì)瘤中的重要性以及可變剪接現(xiàn)象在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要意義，本實(shí)驗(yàn)以此為切入點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)研究。
　　 本研究分兩部分：第一，MDM4三個(gè)新剪接體的發(fā)現(xiàn)，驗(yàn)證及生物信息學(xué)的分析；第二，MDM4剪接體在不同組織標(biāo)本中的表達(dá)及與p53突變的關(guān)系，及其臨床意義。
　　 第一部分，MDM4三個(gè)新剪接體的發(fā)現(xiàn)，驗(yàn)證及生物信息學(xué)分析

4、>　　 目的：研究MDM4基因在腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中mRNA剪接形式，明確是否有新型剪接體存在，并針對(duì)新發(fā)現(xiàn)的剪接體利用生物信息學(xué)進(jìn)行其結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行初步分析。
　　 方法：根據(jù)MDM4的cDNA序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，應(yīng)用RT-PC方法檢測MDM4mRNA在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)。通過巢式PCR，二次PCR明確產(chǎn)物的特異性，DNA測序，BLAST確定該剪接體的序列及可變剪接方式。Genebank比對(duì)及Pubmed文獻(xiàn)搜索，最終確定為新型剪接體；

5、進(jìn)一步利用ExPASy以及SWISS-MODEL，針對(duì)MDM4-1，MDM4-2，MDM4-3三種新型剪接體可能翻譯的蛋白進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)及功能初步預(yù)測。
　　 結(jié)果：RT-PCR提示產(chǎn)物有六條帶，選取效果最佳的引物(EXON10)，經(jīng)二次PCR，巢式PCR，排除非特異性產(chǎn)物，通過比對(duì)Marker其分子量分別為：800-900左右，750-800左右，700左右，650左右，550左右，450-500左右；與預(yù)期的5條帶，851，7

6、83，701，607，163有不相符之處，提示可能有新型剪接體的存在；進(jìn)一步針對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行割膠，純化，直接測序，并將序列進(jìn)行Blast，發(fā)現(xiàn)前三條帶(由高到低)分別符合已報(bào)道的MDM4-FL，MDM4-S，MDM4-A；后三條帶(由高到低)分別為缺失exon6，9；exon8，9；exon6，8，9，通過Genebank及Pubmed文獻(xiàn)搜索，均未見報(bào)道，最終確定為MDM4基因新型剪接體，命名為MDM4-1，MDM4-2，MDM4。

7、針對(duì)3種新型剪接體(MDM4-1，MDM4-2，MDM4-3)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，剪接體可能編碼的蛋白分別為140aa，172aa，140aa；MDM4-1及MDM4-3均缺失exon6，對(duì)p53結(jié)合域結(jié)構(gòu)沒有影響，但終止密碼子在exon7上提前出現(xiàn)，缺失鋅指結(jié)構(gòu)及環(huán)指結(jié)構(gòu)等，最終可能編碼與MDM4-S相同的蛋白。MDM4-2缺失exon8，9，終止密碼子在exon10上提前出現(xiàn)，缺失片段為富酸性殘基結(jié)合域，可能影響CK1alpha介導(dǎo)

8、的MDM4磷酸化過程，最終影響MDM4對(duì)p53的抑制。最后利用ExPASy以及SWISS-MODEL，針對(duì)MDM4-1，MDM4-2，MDM4-3可能翻譯的蛋白進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)預(yù)測，為進(jìn)一步探討其功能奠定基礎(chǔ)。
　　 結(jié)論：MDM4在腦膠質(zhì)瘤組織中的mRNA剪切形式有6種，其中3種已有報(bào)道，另外3種尚未報(bào)道，命名為MDM4-1，MDM4-2，MDM4-3；可變剪接形式均為外顯子缺失，分別缺失exon6，9；exon8，9，exon6

9、，8，9。三種新型剪接體p53結(jié)合域均存在，可能翻譯的氨基酸大小分別為：140aa，172aa，140aa；其中MDM4-1，MDM4-2可能編碼與MDM4-S相同的蛋白，最終利用ExPASy以及SWISS-MODEL，針對(duì)MDM4-1，MDM4-2，MDM4-3三種新型剪接體可能翻譯的蛋白進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)預(yù)測。新型剪接體結(jié)構(gòu)上存在p53結(jié)合域，可能對(duì)于MDM4基因參與p53通路的精細(xì)調(diào)控有重要意義。
　　 第二部分，MDM4剪接體

10、在不同組織標(biāo)本中的表達(dá)及與p53的關(guān)系，及其臨床意義
　　 目的：了解本實(shí)驗(yàn)第一部分中發(fā)現(xiàn)的3種新型剪接體MDM4-1，MDM4-2，MDM4-3；在不同腫瘤組織中的表達(dá)情況，在膠質(zhì)瘤中不同級(jí)別中表達(dá)情況，與p53，MDM2等基因之間的關(guān)系。檢測p53的突變情況，進(jìn)一步分析MDM4剪接體，p53突變與臨床病理的聯(lián)系，以及對(duì)患者生存預(yù)后的意義。
　　 方法：通過顱內(nèi)外腫瘤，顱內(nèi)良惡性腫瘤，不同級(jí)別膠質(zhì)瘤進(jìn)行RT-PCR，了

11、解新型剪接體在不同腫瘤組織，膠質(zhì)瘤不同級(jí)別間的表達(dá)；進(jìn)一步用Real-timePCR，對(duì)新型剪接體在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)進(jìn)行定量；利用PCR-SSCP檢測不同膠質(zhì)瘤患者p53突變情況，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析MDM4剪接體與MDM2，p53之間的關(guān)系，同時(shí)探索其表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床病理特征及腫瘤預(yù)后的關(guān)系。
　　 結(jié)果：RT-PCR提示MDM4-1，MDM4-2，MDM4-3三個(gè)新型剪接體在多種腫瘤組織及正常組織中均有表達(dá)，并非在腫瘤中特

12、異性表達(dá)。在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中均有表達(dá)，并非在特定級(jí)別中特異表達(dá)。但出現(xiàn)的條帶強(qiáng)弱不一，其中新型剪接體在低級(jí)別腫瘤中(Ⅰ級(jí)，Ⅱ級(jí))表達(dá)明顯，在Ⅲ級(jí)，Ⅳ級(jí)中表達(dá)較弱。Real-timePCR提示MDM4-1/MDM4-FL比值在不同病理級(jí)別間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，隨著病理級(jí)別增加且呈負(fù)相關(guān)(圖2.8)。MDM4-S/MDM4-FL比值在不同病理級(jí)別間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，隨著病理級(jí)別增加呈正相關(guān)。MDM4-MDM2-p5

13、3作為p53信號(hào)通路上重要的信號(hào)分子，三者在mRNA水平上彼此相關(guān)。PCR-SSCP檢測p53突變情況，提示74例膠質(zhì)瘤患者中，p53突變率為39.2％(29/74)，突變的位點(diǎn)分別位于p53基因的exon5-8上。其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，間變形星形膠質(zhì)瘤突變率最高，分別達(dá)44.4％，52.6％；正常腦組織，毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤，室管膜瘤均未見突變。結(jié)合臨床資料提示：p53突變率與性別，年齡，病理類型無顯著相關(guān)；但與病理級(jí)別顯著相關(guān)(p＜0.0

14、5)，高級(jí)別膠質(zhì)瘤(WHOⅢ級(jí)，Ⅳ級(jí))明顯高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤(WHOI級(jí)，Ⅱ級(jí))分別為52.6％，26.1％。p53突變型與野生型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤各5例；行Real-timePCR檢測MDM4基因及其剪接體的表達(dá)量；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，MDM4-FL，MDM4-1的表達(dá)量，均存在顯著差異(P＜0.05)。MDM4基因的mRNA表達(dá)量在p53野生型的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中要明顯高于p53突變性型。而MDM4-1的表達(dá)量在p53突變的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中要明

15、顯高于p53野生型。33例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤根據(jù)MDM4-1的平均表達(dá)量分為兩組，＞0.08為相對(duì)高表達(dá)組，＜0.08為相對(duì)低表達(dá)組。Kaplan-Meier法計(jì)算各組累計(jì)生存時(shí)間，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示相對(duì)高表達(dá)組生存時(shí)間14.4月(95％CI10.7，18.1)，相對(duì)低表達(dá)組生存時(shí)間23.6月(95％CI13.9，23.9)。K-M生存曲線分析顯示，MDM4-1低表達(dá)組患者生存時(shí)間長于MDM4-1高表達(dá)組(p＜0.05)。27例經(jīng)p53突變檢測的膠

16、質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，采用Kaplan-Meier法計(jì)算各組累計(jì)生存時(shí)間，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示p53突變型組生存時(shí)間11.4月(95％CI7.9，12.1)，p53野生型組生存時(shí)間22.0月(95％CI13.9，46.1)，K-M生存曲線顯示，p53野生型組患者生存時(shí)間長于p53突變型組(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：MDM4基因的3個(gè)新剪接體在顱內(nèi)外腫瘤中均有表達(dá)，在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中，MDM4-1/MDM4-FL比值隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增加而下

17、降；MDM4-S/MDM4-FL比值隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增加而增加。MDM4-FL，MDM2，p53三者表達(dá)有顯著相關(guān)。標(biāo)本p53突變率為37.7％(29/77)，突變的位點(diǎn)分別位于p53基因的exon5-8上。其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，間變形星形膠質(zhì)瘤突變率最高。p53突變率在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中顯著高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤；在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中MDM4-FL的表達(dá)量在野生型的標(biāo)本中顯著高于突變型，MDM4-1則相反。臨床隨訪生存分析，提示MDM4-1的高表達(dá)，以