IS256在糞腸球菌氨基糖苷類雙功能修飾酶耐藥基因轉(zhuǎn)移中的作用研究.pdf

1、腸球菌是人類胃腸道和女性泌尿生殖道的正常菌群，屬條件致病菌，廣泛的存在于人體和自然環(huán)境中，可引起尿路感染、皮膚軟組織感染，對免疫力低下者可致嚴重感染，如心腹腔感染、內(nèi)膜炎、菌血癥和腦膜炎等。近年來，腸球菌成為院內(nèi)重要的感染源。在腸球菌感染病例中，糞腸球菌占絕對多數(shù)，約85％-90%，屎腸球菌占5%～10%，其余的腸球菌（如堅韌腸球菌、鉛黃腸球菌、鶉雞腸腸球菌、鳥腸球菌）很少有報道。對于腸球菌嚴重感染臨床上常選用作用于細胞壁的藥物與氨基糖

2、苷類抗生素聯(lián)合用藥，而高水平慶大霉素耐藥(HLGR)使這種協(xié)同殺菌作用消失。HLGR主要歸因于氨基糖苷類雙功能修飾酶(AAC-APH)的存在。AAC-APH基因形成轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)(Tn5281)，并且多數(shù)定位于質(zhì)粒中，易于轉(zhuǎn)移至非HLGR的菌株中，引起其高水平耐藥。完整結(jié)構(gòu)的Tn5281轉(zhuǎn)座子在其AAC-APH基因兩側(cè)存在反向重復的插入序列IS256，而腸球菌里發(fā)現(xiàn)的截斷結(jié)構(gòu)的類Tn5281轉(zhuǎn)座子表現(xiàn)為雙功能修飾酶基因一端或者兩端缺失插入序

3、列IS256。
　　 IS256屬于一個大的家族，其成員在革蘭氏陽性菌和陰性菌中均有分布。已有研究發(fā)現(xiàn)IS256插入序列可激活葡萄球菌耐藥基因的轉(zhuǎn)錄，并且有報道顯示IS256與表皮葡萄球菌慶大霉素耐藥有顯著相關(guān)性，因此我們推測作為雙功能修飾酶轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)一部分的IS256與腸球菌慶大霉素耐藥性存在關(guān)系，并且很可能與雙功能修飾酶耐藥基因的轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　 據(jù)此，本論文選取2006-2009年北京地區(qū)臨床分離腸球菌來研究IS2

4、56在雙功能修飾酶耐藥基因轉(zhuǎn)移中的作用。首先通過高水平慶大霉素耐藥(HLGR)篩選、雙功能修飾酶基因（aac-aph）檢測等分離出HLGR且aac-aph陽性菌株或非HLGR且aac-aph陰性菌株。對于HLGR且aac-aph陽性者，PCR檢測確定其轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)及菌株內(nèi)是否存在IS256基因，將菌株分為H1-H6組，為接合轉(zhuǎn)移實驗的供體菌庫；而對于非HLGR且aac-aph陰性組，PCR檢測菌體內(nèi)IS256存在與否，將菌株分為NH1和N

5、H2組，然后自發(fā)突變或誘導突變制備夫西地酸、利福平耐藥株，作為接合轉(zhuǎn)移實驗的受體菌庫。采用濾膜法進行供體菌庫菌株與JH2-2，HH22與受體菌庫菌株，供體菌庫菌株與受體菌庫菌株間的接合轉(zhuǎn)移實驗，計算接合轉(zhuǎn)移效率。依據(jù)接合轉(zhuǎn)移成功率、接合轉(zhuǎn)移效率與IS256在供體菌和受體菌的存在狀況來系統(tǒng)評判JS256在雙功能修飾酶耐藥基因轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 研究中我們共測定了2006-2009年北京地區(qū)169株臨床分離糞腸球菌和21株臨床分離

6、屎腸球菌的高水平慶大霉素耐藥性、雙功能修飾酶耐藥基因及其轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)、IS256存在狀況。結(jié)果顯示，169株糞腸球菌中，111株(65.7%)為HLGR株，而且HLGR菌中97.3%含有雙功能修飾酶基因aac-aph，其中10.2%含有完整結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)座子（aac-aph兩端均含有IS256插入序列），89.8%含有截斷結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)座子（缺失一端或兩端的插入序列）。21株屎腸球菌中，15株(71.4%)為HLGR株，而且所有HLGR菌株均含有aa

7、c-aph，其中13.3%含有完整結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)座子，86.7%含有截斷結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)座子。對插入序列IS256檢測結(jié)果顯示，HLGR菌株中，IS256的檢出率為47.6%，而非HLGR菌株中，IS256的檢出率僅為9.4%。
　　 濾膜法接合轉(zhuǎn)移實驗結(jié)果顯示，108株HLGR且aac-aph陽性糞腸球菌作為供體菌與JH2-2進行接合轉(zhuǎn)移實驗時,42株菌株將aac-aph基因轉(zhuǎn)移至糞腸球菌JH2-2中，轉(zhuǎn)移成功率為38.9%。其中H1組為9

8、/57(15.8%)，H2組為1/3(33.3%)，H3組為1/4(25.0%)；H4組為9/16(56.3%)；H5組為13/17(76.5%)；H6組為9/11(81.8%)。IS256陰性菌株H1+H2組的總轉(zhuǎn)移成功率為10/60(16.7%)，IS256陽性菌株H3+H4+H5+H6組的總轉(zhuǎn)移成功率為33/48(68.8%)；兩端缺失插入序列的H1+H2+H3組的總轉(zhuǎn)移成功率為11/64(17.2%)，一端缺失插入序列的H4+H

9、5組的總轉(zhuǎn)移成功率為22/33(66.7%)，完整轉(zhuǎn)座子H6組的轉(zhuǎn)移成功率為9/11(81.8%)。以上結(jié)果表明供體菌中IS256的存在有助于接合轉(zhuǎn)移的成功，并且轉(zhuǎn)座子中IS256存在與否對接合轉(zhuǎn)移成功率的影響為：完整結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)座子接合轉(zhuǎn)移成功率>一端缺失插入序列轉(zhuǎn)座子>兩端缺失插入序列轉(zhuǎn)座子。而接合轉(zhuǎn)移效率的結(jié)果（經(jīng)接合轉(zhuǎn)移質(zhì)控對HH22：JH2-2標準化后的數(shù)據(jù)）顯示，完整結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)座子的接合轉(zhuǎn)移效率（H6組，1.29×10-2～6.84×

10、102）>兩端均完全缺失IS256的轉(zhuǎn)座子的接合轉(zhuǎn)移效率（H1組，1.78×10-3～6.21×101;H3組，1.02×100）>-端存在或部分存在IS256的轉(zhuǎn)座子的接合轉(zhuǎn)移效率(H2組，1.30×10-3;H4組，1.32×10-3～1.85×10-1;H5組，1.30×10-3～5.46×100).
　　 12株（11株IS256陰性，1株IS256陽性）非HLGR且aac-aph陰性糞腸球菌作為受體菌與HH22進行接合

11、轉(zhuǎn)移實驗時，2株菌株（均為IS256陰性）接合轉(zhuǎn)移成功。4株HLGR且aac-aph陽性臨床分離糞腸球菌作為供體菌將aac-aph轉(zhuǎn)移至臨床分離受體菌08-15和／或08-20中，說明在一定條件下，雙功能修飾酶耐藥基因可在臨床分離菌株之間傳播。
　　 2006-2009年北京地區(qū)臨床分離腸球菌HLGR率高，并且絕大多數(shù)HLGR腸球菌含aac-aph，通常形成截斷結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)座子。受試糞腸球菌轉(zhuǎn)座子中雙功能修飾酶基因兩端IS256的存