Fe2+和-胰島素對葡萄糖預(yù)處理的人臍靜脈平滑肌細(xì)胞增殖及MMP-2分泌的作用.pdf

1、研究背景：
　　冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病（coronary heart disease，CHD），是影響人類健康的主要疾病之一，經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)成形術(shù)（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）目前已經(jīng)成為一種常規(guī)有效的治療CHD的方法。藥物支架（drug-eluting stent，DES）的使用使支架置入術(shù)后支架內(nèi)再狹窄（in-stent restenosi

2、s，ISR）的發(fā)生率降低到5～10％左右，但仍然無法徹底解決ISR的問題。大量的多中心、隨機和雙盲對照研究顯示，糖尿?。╠iabetesmillitus，DM）患者PTCA的療效差，ISR發(fā)生率較高[1-3]，具體機制的研究仍不夠深入，因而嚴(yán)重影響其臨床應(yīng)用。同時有研究顯示，置入體內(nèi)的金屬支架在體內(nèi)會以“洗脫”的方式脫出Fe2+[4]，不同類型支架“洗脫”到支架周圍的Fe2+量并非完全一致，而且其對與之直接接觸的血管平滑肌細(xì)胞（vasc

3、ular smooth muscle cells，VSMC）的生物功能的影響尚不清楚。有研究認(rèn)為Fe2+對VSMC增殖有一定程度抑制作用[5]，此研究結(jié)論似乎與臨床觀察到的現(xiàn)象不相符合。為此，本研究采用原代培養(yǎng)的3～5代人臍靜脈平滑肌細(xì)胞（human umbilical vascular smooth muscle cell，HUSMC），參照上述研究[5]采用的Fe2+濃度梯度分組，分別用普通培養(yǎng)液模擬正常人體內(nèi)環(huán)境、高糖培養(yǎng)液模擬人

4、體內(nèi)高糖環(huán)境、高胰島素環(huán)境模擬人體高胰島素環(huán)境培養(yǎng)HUVSMC，以研究Fe2+、胰島素對其增殖以及金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）分泌功能的影響，探討血糖異常和/或胰島素抵抗患者體內(nèi)金屬支架ISR發(fā)生的可能機制并找尋臨床證據(jù)。
　　研究目的：
　　1.觀察Fe2+對葡萄糖預(yù)孵育的VSMC增殖及MMP-2分泌的影響。
　　2.觀察胰島素對葡萄糖預(yù)孵育的VSMC增殖及MMP

5、-2分泌的影響。
　　3.觀察Fe2+對葡萄糖和胰島素預(yù)孵育的VSMC增殖、MMP-2分泌以及VSMC胞內(nèi)Ca2＋濃度的影響。
　　4.探討其可能的作用機制。
　　第一部分：
　　方法：
　　健康產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)分娩的無菌胎兒臍帶分離出臍靜脈，組織塊法培養(yǎng)HUVSMC，取生長穩(wěn)定的3～5代細(xì)胞，分為正常組（葡萄糖5mmol/L）以及高糖組（葡萄糖25mmol/L）的。
　　1.各分為六個亞組：①空白對照組O

6、；②Fe2+組A（0.00625mg/mL）；③Fe2+組B（0.0125mg/mL）；④Fe2+組C（0.025mg/mL）；⑤Fe2+組D（0.05mg/mL）；⑥Fe2+組E（0.1mg/mL）。37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)干預(yù)24h。
　　2.MTT比色法測定細(xì)胞增殖情況。
　　3.ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中MPP-2含量。
　　結(jié)果：
　　1.正常組：與O組比，B～E組對VSMC有促進(jìn)增殖作用（P

7、＜0.05）；僅E組能明顯促進(jìn)VSMC分泌MMP-2（P＜0.01），其余各組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.高糖組：與O組比，B～E組，能促進(jìn)VSMC增殖（P＜0.01）及MMP-2的分泌，D組、E組促進(jìn)作用最強。
　　3.正常組與高糖組比較：B～E各相應(yīng)亞組間，高糖組對VSMC增殖及MMP-2分泌的促進(jìn)作用較正常組強（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　正常及高葡萄糖環(huán)境，適當(dāng)?shù)臐舛菷e2+能影響VSMC

8、的生物學(xué)特性，促進(jìn)VSMC的增殖與MMP-2的分泌，且高糖環(huán)境下作用更為顯著。
　　第二部分：
　　方法：
　　1.同實驗一。
　　2.各分為4個亞組：①空白對照組O；②胰島素組A（10mIU）；③胰島素組B（100mIU）；④胰島素組C（1000mIU）。37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)干預(yù)48h。
　　3.MTT比色法測定細(xì)胞增殖情況。
　　4.ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中MPP-2含量。

9、　　結(jié)果：
　　1.正常組：與O組比，各亞組均可促進(jìn)VSMC增殖（P＜0.01）及MMP-2的分泌（P＜0.01），且B組（100mIU）作用最強。
　　2.高糖組：與O組比，A組、B組均促進(jìn)VSMC的增殖（P＜0.05）；但A、B、C三個亞組均能促進(jìn)MMP-2的分泌（P＜0.01），且B組（100mIU/L）作用最強。
　　3.正常組與高糖組比較：A、B各相應(yīng)亞組間，高糖組對VSMC增殖及分泌MMP-2作用較正常組強

10、（P＜0.05），而相應(yīng)C組間高糖組對VSMC增殖及分泌MMP-2作用較正常組弱（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　正常及高葡萄糖環(huán)境，適當(dāng)濃度的胰島素能促進(jìn)VSMC增殖及MMP-2的分泌，效應(yīng)具有濃度依賴性；且高糖環(huán)境下促進(jìn)作用更為顯著。
　　第三部分：
　　方法：
　　1.同實驗一。
　　2.各分為4個亞組：①空白對照組O（10％FBS的DMEM，72h）；②Fe2+組A（10％FBS的DMEM，

11、48h+0.05mg/mLFe2+，24h）；③胰島素組B（10％FBS的DMEM，24h+100mIU胰島素，48h）；④胰島素+Fe2+組C（100mIU胰島素，48h+100mIU胰島素及0.05mg/mLFe2+，24h）。
　　3.MTT比色法測定細(xì)胞增殖情況。
　　4.ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中MPP-2含量。
　　5.激光共聚焦法測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。
　　結(jié)果：
　　1.正常組：與

12、O比較，A、B、C各組VSMC內(nèi)Ca2+濃度均升高，VSMC增殖及MMP-2分泌能力增強。其中A、B組較C組促進(jìn)VSMC胞內(nèi)Ca2+濃度升高的作用高（P＜0.01），促進(jìn)VSMC增殖及MMP-2分泌作用強（P＜0.05）。
　　2.高糖組：與O比較，A、B、C各組VSMC內(nèi)Ca2+濃度均升高，VSMC增殖及MMP-2分泌能力增強。其中A、B組促進(jìn)VSMC胞內(nèi)Ca2+濃度升高、促進(jìn)MMP-2分泌作用較C組強（P＜0.01），三組促進(jìn)

13、VSMC增殖作用無明顯差異（P=0.484）。
　　3.正常組與高糖組比較：高糖組A、B各相應(yīng)亞組間對VSMC增殖及分泌MMP-2作用較正常組強（P＜0.05），C組兩相應(yīng)亞組間無明顯差異（P=0.167）。高糖組A～C各亞組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度均高于正常組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　正常及高葡萄糖環(huán)境下，適當(dāng)濃度的胰島素、Fe2+能促進(jìn)VSMC增殖、MMP-2的分泌以及VSMC胞內(nèi)Ca2+濃度升高，且高糖組促進(jìn)