呼吸道合胞病毒治療性單克隆抗體的制備及其免疫保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：人呼吸道合胞病毒（Human Respiratory Syncytial Virus，RSV）廣泛分布于世界各地，是導(dǎo)致嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染最重要的病毒病原。病毒感染機(jī)體后的免疫保護(hù)機(jī)制尚未明確，也無特異性防治方法。本研究嘗試?yán)秒s交瘤技術(shù)，制備具有中和活性的單克隆抗體，并開展RSV免疫治療研究，以期為研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的RSV治療性單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：用RSV活病毒通過滴鼻免疫小鼠，取免疫小鼠的脾臟與骨

2、髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，通過有限稀釋法亞克隆和間接ELISA進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定分泌抗RSV單克隆抗體（Monoclonal antibody，McAb）的雜交瘤細(xì)胞株。將雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔誘生腹水，利用G蛋白親和層析法從腹水中純化抗體。使用SDS-PAGE檢測純化后抗體的純度，間接ELISA、間接免疫熒光（indirect immunoflurescence，IIF）和Western blot方法分析抗體對RSV融合蛋白（fusion

3、 protein，F(xiàn)）的特異性結(jié)合能力，間接ELISA、非競爭ELISA及競爭ELISA分別測定抗體的亞型、親和常數(shù)和抗原識別表位，為了更好的開展抗體生物活性研究，我們還建立了免疫酶法（immunoenzyne，IE）分析RSV病毒滴度的方法，應(yīng)用IE法體外蝕斑減少中和實驗，確定該株單抗的中和活性，并計算中和效價，通過融合抑制實驗確定該株單抗是否具有融合抑制活性。用Trizol法從雜交瘤細(xì)胞株中提取總RNA，應(yīng)用鼠源抗體重鏈和輕鏈通用引

4、物，通過PCR擴(kuò)增抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因，并克隆入pGEM-T載體中，進(jìn)行核酸序列分析，并與現(xiàn)有的RSV單克隆抗體進(jìn)行同源性比對。利用RSV感染的動物模型，進(jìn)一步分析單克隆抗體的體內(nèi)中和活性。
　　 結(jié)果：獲得1株穩(wěn)定分泌抗RSV F蛋白的雜交瘤細(xì)胞株F8，純化后抗體的純度達(dá)到95％以上。該單抗能夠識別F蛋白單體，抗體亞型為IgG1，親和常數(shù)（Ka）為6.8×108 L/mol，抗原識別表位位于F蛋白的抗原表位區(qū)205-22

5、2位氨基酸。該株單抗可以在體外抑制RSV對Hep-2細(xì)胞的感染，具有中和活性，同時具有融合抑制活性。擴(kuò)增出抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因，并克隆入pGEM-T載體中。測序結(jié)果顯示重鏈可變區(qū)基因序列全長371 bp，編碼124個氨基酸；輕鏈可變區(qū)基因序列全長323 bp，編碼107個氨基酸，在GeneBank對氨基酸序列進(jìn)行比對分析，兩者均符合小鼠IgG可變區(qū)基因的特征。與美國專利網(wǎng)上提交的具有中和活性的RSV鼠源單抗的重鏈輕鏈同源性分別為95

6、.37％與75.4％?？贵w體內(nèi)保護(hù)實驗顯示，該抗體可降低感染RSV小鼠的肺臟病毒滴度。
　　 結(jié)論：制備了能特異性識別RSV F蛋白的單克隆抗體F8，完成了純化和性質(zhì)鑒定，擴(kuò)增出抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因，與已知的具有中和活性的RSV單抗的可變區(qū)基因有較高的同源性，可以確定所得到的序列為RSV抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)序列，而非其他基因的序列。以IE法為基礎(chǔ)的RSV病毒滴度分析方法顯示F8在體內(nèi)體外具有中和活性和融合抑制活性，為RSV感