間接免疫熒光法篩選抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體及其性質(zhì)的初步鑒定.pdf

1、目的:人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,RSV)是造成世界范圍內(nèi)嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染最重要的病毒病原,同時(shí)也可導(dǎo)致老年人、免疫功能低下者嚴(yán)重的呼吸道感染。病毒感染機(jī)體后的免疫保護(hù)機(jī)制尚未明確,也無(wú)特異性防治方法。融合糖蛋白(fusion glycoprotein,F)與黏附糖蛋白(attachment glycoprotein,G)為RSV的兩個(gè)中和抗原,都可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。R

2、SV疫苗及以預(yù)防為目的的單克隆抗體的研發(fā)常以這兩個(gè)蛋白為重要的靶蛋白。在前期研究中,本課題組已采用間接ELISA法篩選出針對(duì)RSV F蛋白線性表位205-222位氨基酸的單克隆抗體。本研究嘗試進(jìn)一步利用活體骨髓瘤細(xì)胞與雜交瘤技術(shù),采用間接免疫熒光分析法(indirect immunoflurescence assay,IFA)篩選出更多可識(shí)別RSV的單克隆抗體,并對(duì)其體外性質(zhì)進(jìn)行鑒定,以期為RSV的被動(dòng)免疫治療以及臨床診斷奠定基礎(chǔ)。

3、r>　　方法:以RSV通過(guò)滴鼻途徑免疫小鼠,同時(shí),采用實(shí)體瘤技術(shù)體內(nèi)制備骨髓瘤細(xì)胞。取免疫后小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合,利用IFA方法篩選經(jīng)有限稀釋法亞克隆獲得的可穩(wěn)定分泌抗RSV單克隆抗體(Monoclonal antibody,McAb)的雜交瘤細(xì)胞株。通過(guò)間接ELISA和Western blot等方法初步分析McAb對(duì)RSV蛋白的特異性結(jié)合能力,通過(guò)免疫酶法(Immunoenzyme,IM)中和保護(hù)實(shí)驗(yàn)和融合抑制實(shí)驗(yàn)分析

4、McAb體外保護(hù)作用。
　　結(jié)果:獲得四株穩(wěn)定分泌抗RSV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別為2A7、3E10、1F10及3G4,經(jīng)間接ELISA以及Western blot初步鑒定,獲得的四株單克隆抗體可特異性識(shí)別RSV蛋白,McAbs2A7和3E10可分別識(shí)別F蛋白二聚體和單體,McAbs1F10和3G4可識(shí)別G蛋白。其中McAbs2A7與1F10可以在體外抑制RSV對(duì)HEp-2細(xì)胞的感染,具有中和活性,同時(shí)具有融合抑制活性。