微囊蛋白-1對(duì)創(chuàng)作后內(nèi)皮祖細(xì)胞功能受損的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、創(chuàng)傷會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的靶細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，同時(shí)由于感染所致的膿毒癥及非感染所致的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)相互作用使得自體修復(fù)功能障礙，并進(jìn)一步造成微血管損傷、微循環(huán)障礙，從而引起重要臟器功能障礙，這可能就是多器官功能障礙(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)的始發(fā)環(huán)節(jié)。而MODS是重癥監(jiān)護(hù)病房(intensivecareunit

2、，ICU)患者死亡的最常見原因。
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcell，EPC)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在生理或病理因素刺激下，可從骨髓及其它組織被動(dòng)員到外周血進(jìn)行損傷的修復(fù)。內(nèi)皮祖細(xì)胞又稱為血管母細(xì)胞(angioblast)，既參與出生后的血管生成(angiogenesis，AG)，同時(shí)亦參與機(jī)體、器官損傷后的血管再生與修復(fù)。1997年，Asahara等首次證明循環(huán)外周血中存在能分化為血管內(nèi)皮

3、細(xì)胞的前體細(xì)胞，并將其命名為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。近年來的研究顯示，內(nèi)皮祖細(xì)胞是參與出生后生理性及病理性血管形成最主要的細(xì)胞，同時(shí)可以在體內(nèi)分化為內(nèi)皮細(xì)胞，并參與心、肝、腎等單個(gè)器官損傷或器官衰竭時(shí)的修復(fù)。因此，內(nèi)皮祖細(xì)胞在創(chuàng)傷后缺血性疾病和創(chuàng)傷修復(fù)等過程中的具有重要治療作用和廣闊的臨床應(yīng)用前景。
　　 微囊蛋白(Caveolin)，又稱小窩蛋白，為小窩最主要組成蛋白，屬整合膜蛋白。微囊蛋白家族包括Caveolin-1，Caveoli

4、n-2，Caveolin-3，其主要的作用是把細(xì)胞外的生物活性分子向胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，并在胞內(nèi)運(yùn)輸并參與多種信號(hào)的接收和轉(zhuǎn)運(yùn)，其生理功能主要表現(xiàn)在維持細(xì)胞進(jìn)出平衡，參與細(xì)胞增殖、遷移和信號(hào)傳遞。微囊蛋白-1(Caveolin-1)是其主要組成蛋白，能直接與多種信號(hào)分子如G蛋白a亞單位、Ha-Has、Src酪氨酸激酶家族成員(Src，F(xiàn)yn等)、EGF受體、胰島素受體、PKC、eNOS等連接，從而調(diào)控這些信號(hào)分子的活性狀態(tài)。TanZh等研究發(fā)現(xiàn)雌

5、激素可以通過提高Caveolin-1的表達(dá)從而促進(jìn)EPC的增殖和分化，同時(shí)Caveolin-1的表達(dá)強(qiáng)度和EPC的功能密切相關(guān)。
　　 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Caveolin-1是體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的樞紐，可以能直接與多種信號(hào)分子如G蛋白a亞單位、Ha-Has、Src酪氨酸激酶家族成員等連接，調(diào)控這些信號(hào)分子的活性狀態(tài)。有研究顯示：通過藥物干預(yù)或剔除Caveolin-1可使PI3K表達(dá)下降，用β-環(huán)糊精抑制Caveolin-1可阻止PI

6、3K活化。活化的PI3K可以激活其下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路磷脂酰肌醇激酶-3/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶/內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(PI3K/Akt/eNOS)，而該信號(hào)通路下游的內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)的完整與否直接影響到EPC的動(dòng)員、增殖和分化；而無論是PI3K/Akt/eNOS通路上游的磷脂酰肌醇激酶-3(PI3K)和絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(Akt)；還是下游的eNOS的效應(yīng)子一氧化氮(NO)對(duì)EPC的動(dòng)員、遷徙及血管形成功能都有非常重

7、要的調(diào)節(jié)功能。Everaert研究發(fā)現(xiàn)，PI3K的活化能使其下游的Akt磷酸化，磷酸化的Akt可直接磷酸化eNOS，導(dǎo)致eNOS被激活，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮大量合成NO。NO可以通過作用于金屬基質(zhì)蛋白-9(mmp-9)促進(jìn)EPC的動(dòng)員、遷徙和血管形成功能，并可滅活細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶caspase-3和caspase-6等，從多條途徑抑制EPC和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　 本研究通過從不同組織(外周血、骨髓、臍血和臍帶)中成功分離培養(yǎng)出內(nèi)皮祖

8、細(xì)胞，并在體外模擬缺血、缺因子環(huán)境下培養(yǎng)EPC，使EPC受損，觀察EPC表面Caveolin-1的表達(dá)與EPC功能的關(guān)系，并在EPC體外培養(yǎng)體系中，利用RNA干擾技術(shù)調(diào)控Caveolin-1的表達(dá)強(qiáng)度，以及嘗試阻斷Caveolin-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/Akt/eNOS，觀察EPC功能的變化。以明確Caveolin-1與EPC功能的相關(guān)性及其調(diào)控作用機(jī)制，從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的角度進(jìn)一步研究MODS的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，并通過改善創(chuàng)傷后內(nèi)皮祖細(xì)

9、胞功能，為有效防治MODS提供確實(shí)的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為臨床創(chuàng)傷后MODS的有效防治提供新的方法。
　　 第一部分，不同組織來源的人內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 目的：從不同組織中分離培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，并對(duì)比不同組織來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的優(yōu)劣，從而挑選出組織來源方便及功能優(yōu)良的內(nèi)皮祖細(xì)胞，為最終能夠獲得用于細(xì)胞移植或組織工程的種子細(xì)胞提供基礎(chǔ)。
　　 方法：采用密度梯度差速貼壁培養(yǎng)法及組織塊植塊法，分別從

10、外周血、骨髓、臍帶血及臍帶組織中分離培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞免疫表型、乙?；牡兔芏戎鞍?Dil-Ac-LDL)和荊豆凝集素-1(FITC-LTEA-1)的吞噬功能、體外血管生成功能進(jìn)行鑒定，并對(duì)比不同組織來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的優(yōu)劣。
　　 結(jié)果：除外周血來源的細(xì)胞不能增殖傳代，從骨髓、臍帶血及臍帶組織中均能成功分離培養(yǎng)并擴(kuò)增內(nèi)皮祖細(xì)胞，骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞連續(xù)傳4代以上，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，而臍

11、帶血及臍帶組織來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞可穩(wěn)定傳10代以上，細(xì)胞形態(tài)無明顯改變。細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，繼而增殖加速，周邊出現(xiàn)梭狀分化細(xì)胞，培養(yǎng)至約20天以后，出現(xiàn)了內(nèi)皮細(xì)胞樣的“鋪路石”狀，同時(shí)電鏡觀察細(xì)胞發(fā)現(xiàn)有內(nèi)皮細(xì)胞特有的特征性的Weibel-Palade小體存在，符合內(nèi)皮祖細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型發(fā)現(xiàn)，三種組織來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞都表達(dá)CD133、CD34、CD31和KDR，CD133和CD34的表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間增加逐漸下降，而CD31

12、和KDR的表達(dá)隨時(shí)間增加而升高：雙吞噬功能鑒定發(fā)現(xiàn)超過85％體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞都特異性地?cái)z取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1；體外血管形成實(shí)驗(yàn)顯示：三種組織來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞均具有血管形成能力。對(duì)比三者的功能后發(fā)現(xiàn)，臍帶及臍帶血來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞較骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞，無論是穩(wěn)定維持祖細(xì)胞的特性，還是增殖能力及成血管能力都較強(qiáng)。且按照每根臍帶中位長(zhǎng)30cm計(jì)算，原代平均可獲得大量的內(nèi)皮祖細(xì)胞(約1.51×107個(gè))。
　　

13、 結(jié)論：從骨髓、臍帶血及臍帶組織中能成功分離培養(yǎng)出內(nèi)皮祖細(xì)胞，并能傳代擴(kuò)增。臍帶來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及功能與臍血來源的相似，無論是穩(wěn)定維持祖細(xì)胞的特性，還是增殖能力及成血管能力相對(duì)于骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞來說都較強(qiáng)。且按照每根臍帶中位長(zhǎng)30cm計(jì)算，原代平均可獲得大量的內(nèi)皮祖細(xì)胞(約1.51×107個(gè))，且培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便、可靠。為最終能夠獲得用于細(xì)胞移植或者組織工程的種子細(xì)胞的臨床應(yīng)用做準(zhǔn)備。
　　 第二部分，微囊蛋白-1的

14、表達(dá)與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的相關(guān)性研究
　　 目的：證明內(nèi)皮祖細(xì)胞功能受損時(shí)與其表面的微囊蛋白-1(Caveolin-1)的表達(dá)變化密切相關(guān)。
　　 方法：采用無血清無因子培養(yǎng)法，在體外使臍帶來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞受損，檢測(cè)其增殖和血管形成能力等功能變化及其表面微囊蛋白-1的表達(dá)。再通過RNA干擾技術(shù)抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞表面微囊蛋白-1的表達(dá)后，檢測(cè)其增殖能力和血管形成能力等功能變化。
　　 結(jié)果：無血清無因子培養(yǎng)法可以誘導(dǎo)內(nèi)皮祖

15、細(xì)胞損傷凋亡，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，凋亡增加，并且其血管形成能力也顯著降低，其表面Caveolin-1的表達(dá)較正常組顯著下降(P<0.01)，并且隨著內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷的加重，Caveolin-1的表達(dá)逐漸降低。說明內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能變化與其表面Caveolin-1的表達(dá)相關(guān)。利用RNA干擾技術(shù)成功抑制臍帶來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞Caveolin-1的表達(dá)后，Caveolin-1RNA干擾組細(xì)胞增殖能力明顯下降(P<0.05)，且細(xì)胞的血管形成能力也明顯下降

16、。結(jié)果表明，抑制Caveolin-1mRNA的表達(dá)，可以抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長(zhǎng)和血管形成等功能。
　　 結(jié)論：當(dāng)內(nèi)皮祖細(xì)胞受損時(shí)，其生長(zhǎng)及血管形成能力降低等功能變化與其表面Caveolin-1的表達(dá)密切相關(guān)。抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞Caveolin-1mRNA的表達(dá)后，內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力和血管形成能力顯著下降。從而說明了內(nèi)皮祖細(xì)胞表面Caveolin-1的表達(dá)可以調(diào)控其功能。通過正向調(diào)控Caveolin-1可以改善創(chuàng)傷后內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能，

17、從而為有效防治多器官障礙提供確實(shí)的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 第三部分，微囊蛋白-1對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能調(diào)控的機(jī)制探討
　　 目的：探討Caveolin-1是否通過PI3K/Akt/eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的變化。
　　 方法：在內(nèi)皮祖細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中，分別利用Caveolin-1、PI3K和Akt特異性抑制劑β-環(huán)糊精、LY294002和triciribine阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，觀察該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的

18、下游產(chǎn)物磷酸化Akt蛋白和NO(間接反映eNOS)的表達(dá)情況及內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長(zhǎng)和血管形成等功能變化，以證實(shí)Caveolin-1是否通過PI3K/Akt/eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的變化。
　　 結(jié)果：β-環(huán)糊精、LY294002抑制Caveolin-1和PI3K后，其下游的磷酸化Akt蛋白和NO(間接反映eNOS)表達(dá)均減少，加之triciribine抑制Akt后，eNOS表達(dá)減少，說明β-環(huán)糊精阻斷Caveolin

19、-1后，通過阻止PI3K活化來抑制Akt磷酸化，進(jìn)而影響eNOS的活化造成NO產(chǎn)生減少。三組抑制組細(xì)胞與對(duì)照組相比，其細(xì)胞增殖能力和成血管能力都明顯下降(P<0.05)，說明了Caveolin-1通過PI3K/Akt/eNOS通路可調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能。當(dāng)然，Caveolin-1可能還通過其它通路來調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能，這就需要我們更進(jìn)一步的研究。
　　 結(jié)論：當(dāng)內(nèi)皮祖細(xì)胞受損時(shí)，其表面Caveolin-1表達(dá)降低，細(xì)胞增殖能力

20、和成血管能力隨之下降。內(nèi)皮祖細(xì)胞表面的Caveolin-1表達(dá)減少，影響了PI3K的活化，使Akt磷酸化減少造成eNOS的活化減少，進(jìn)而NO產(chǎn)生減少，導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力和成血管能力等功能下降，進(jìn)而影響機(jī)體修復(fù)。
　　 總之，當(dāng)某些疾病(如缺血、創(chuàng)傷、甚至MODS)造成內(nèi)皮祖細(xì)胞受損時(shí)，內(nèi)皮祖細(xì)胞表面的Caveolin-1表達(dá)減少，影響了PI3K的活化，使Akt磷酸化減少造成eNOS的活化減少，進(jìn)而NO產(chǎn)生減少，導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)