RAPD和ISSR在白術(shù)鑒定中的應(yīng)用.pdf

1、白術(shù)(Atractylodes macrocephala Koidz．)為菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物，其干燥根莖為著名的傳統(tǒng)中藥，具有抗腫瘤、抗衰老等功效，是常用的大宗藥材。目前面臨的問題是白術(shù)的兩個品系—於術(shù)和東術(shù)處于混雜狀態(tài)，急需鑒別、恢復和發(fā)展。本試驗采用ISSR和RAPD分子標記對於術(shù)和東術(shù)進行分析，為白術(shù)分子鑒別提供依據(jù)。 於術(shù)和東術(shù)葉片中含有大量的酚類物質(zhì)，在基因組DNA提取過程中，其與氧接觸極易被氧化成醌而不可逆地結(jié)

2、合在DNA上，從而影響DNA的純度和濃度。本試驗在傳統(tǒng)CTAB法的基礎(chǔ)上，采取先破碎細胞，用除酚緩沖液[100 mmol/LTris-HCI(pH8.0)；50 mmol/LEDTA(pH 8.0)；700 mmol/LNaCl；2﹪PVP(W/V)；2﹪β-巰基乙醇(V/V)]將存在于細胞質(zhì)中影響DNA提取質(zhì)量的多酚等次生代謝物質(zhì)去除后再裂解細胞核，獲得了可用于分子生物學研究的基因組DNA。 采用正交實驗設(shè)計優(yōu)化了RAPD和I

3、SSR反應(yīng)體系，建立了適合于於術(shù)和東術(shù)的最佳反應(yīng)體系：(1)於術(shù)東術(shù)最優(yōu)化RAPD反應(yīng)體系為：在25μl反應(yīng)體系中含Mg<'2+>2.5mmol/L，Taq酶1.25U，模板50ng，dNTP 0.2mmol/L，引物0.5 μmol/L；(2)於術(shù)東術(shù)最優(yōu)化ISSR反應(yīng)體系為：在25μl反應(yīng)體系中含Mg<'2+>3mmol/L，Taq酶0.75U，模板206ng，dNTP0.25mmol/L，引物0.5 μ mol/L。 從7

4、2條RAPD引物中篩選出15條擴增條帶清晰且多態(tài)性豐富的引物對於術(shù)和東術(shù)進行分析，結(jié)果15個RAPD引物共產(chǎn)生112個位點，其中多態(tài)性位點94個，多態(tài)性位點百分率為83.9﹪；從100條ISSR引物中篩選出10條擴增條帶清晰且多態(tài)性豐富的引物對於術(shù)和東術(shù)進行分析，結(jié)果10個ISSR引物共產(chǎn)生114個位點，其中多態(tài)性位點102個，多態(tài)性位點百分率為89.5﹪。 RAPD和ISSR兩種分子標記聚類分析表明於術(shù)和東術(shù)混雜，品系間親緣關(guān)