中國木犀科苦丁茶種質(zhì)資源的RAPD和ISSR分析.pdf

1、本課題應(yīng)用RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，系統(tǒng)地研究了木犀科苦丁茶種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和遺傳多樣性。主要研究結(jié)果如下： 1．在CTAB提取法的基礎(chǔ)上，建立了一種能有效去除多糖等干擾物質(zhì)的總DNA提取方法。用該方法提取木犀科苦丁茶總DNA簡便、快速，并可得到高質(zhì)量的DNA。 2．通過對木犀科苦丁茶RAPD和ISSR分析反應(yīng)體系中主要影響因子進(jìn)行優(yōu)化，確立了這兩種分子標(biāo)記技術(shù)用于木犀科苦丁茶種質(zhì)資源研究時(shí)的最適宜反應(yīng)條件。其中

2、RAPD的最適宜反應(yīng)條件為：10×buffer2．5μl，2．5 mmol/L MgCl2，200μ mol/L dNTPs，Taq酶2．0 U，引物10 pmol，DNA模板80 ng，最后用無菌超純水補(bǔ)足至25μl； PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，然后按94℃變性30 s，37℃退火45 s，72℃延伸120 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。ISSR的最適宜反應(yīng)條件為：10×buffer2．5μl，2．0～

3、3．0 mmol/L MgCl2，150～300μmol/L dNTPs，Taq酶1．0～1．5 U，引物0．4～0．5μmol/L，DNA模板5～320 ng，最后用無菌超純水補(bǔ)足至25μl； PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min，然后按94℃變性40 s，50～54℃退火45 s，72℃延伸120 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8 min。在上述條件下可得到穩(wěn)定性好、重復(fù)性高的PCR擴(kuò)增結(jié)果。 3．在上述反應(yīng)條件下篩

4、選出20條RAPD有效引物和10條ISSR有效引物。利用這20條RAPD引物對木犀科苦丁茶8個(gè)物種[包括粗壯女貞、麗葉女貞（又名興山蠟樹，L．henryi Hemsl．）、日本女貞（L．japonicym Thunb．）、日本毛女貞（L．japonicium Thunb． var。pubscens Koidz）、女貞（L．lucidum Ait．）、序梗女貞（L．pedunculare Rehd）、牛矢果（Osmanthus masum

5、uranus Hayata）和川滇蠟樹（L．delavayanm Hariot）]共21份種質(zhì)材料進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得427條譜帶，PPB（Percentage of polymorphic bands）為97．7％，個(gè)體間遺傳相似系數(shù)在0．1522～0．8322，平均遺傳相似系數(shù)為0．5466；利用10條ISSR引物對木犀科苦丁茶8個(gè)物種（同上）共39份種質(zhì)材料進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得246條譜帶，PPB為98．4％，供試個(gè)體間的遺傳相似系數(shù)在0

6、．1496～0．9518，平均GS為0．6628?；赗APD和ISSR遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類分析圖基本一致，均可把供試材料完全分開并表明它們之間的親緣關(guān)系。分析結(jié)果表明，木犀科苦丁茶各物種間存在著較大的遺傳差異，RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)均可把供試材料明顯分開并表明物種間的親緣關(guān)系，兩種標(biāo)記技術(shù)所得的結(jié)果基本一致；兩種標(biāo)記技術(shù)的結(jié)果均表明，日本毛女貞與序梗女貞的親緣關(guān)系在所有的供試物種中最近，而與日本女貞的關(guān)系較遠(yuǎn)。據(jù)此，作

7、者認(rèn)為，關(guān)于日本毛女貞是否應(yīng)該劃分為日本女貞種下一變種，或是可以獨(dú)立劃分為一個(gè)種的問題，尚需進(jìn)一步研究。此外，兩種分子標(biāo)記技術(shù)的分析結(jié)果均支持紫莖女貞（L．pururascens Y．C．Yang）歸并為粗壯女貞。 4．用所篩選出的19條RAPD隨機(jī)引物和10條ISSR引物對79份不同地域來源的粗壯女貞種質(zhì)材料進(jìn)行擴(kuò)增，分別共擴(kuò)增出369條和181條譜帶，多態(tài)性帶百分率分別為86．0％和89．0％，各種質(zhì)材料間的GS值變化范圍分

8、別為0．4664～0．9736和0．4167～0．9785，平均GS值分別為0．6623和0．6179。這表明RAPD和ISSR可以應(yīng)用于粗壯女貞種內(nèi)遺傳多樣性分析；同時(shí)也表明，粗壯女貞種內(nèi)不同地域來源或不同類群種質(zhì)材料之間有著豐富的遺傳多樣性，存在著較大的遺傳差異?；赗APD和ISSR遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類結(jié)果基本相似，各供試材料均按地理起源聚類，可把所有粗壯女貞供試材料分為兩大類群：A類群（貴州—四川群類）和B類群（云南群類

9、）。 5．應(yīng)用10條ISSR引物在24份女貞種質(zhì)材料中共擴(kuò)增出157條譜帶，檢測到79．6％的多態(tài)性帶，各種質(zhì)材料間的GS值在0．5185～0．8478之間，平均GS值為0．6718。由此可見，女貞種內(nèi)存在較大的遺傳變異，具有豐富的遺傳多樣性。從聚類結(jié)果看，產(chǎn)自同一地方的材料基本上是聚在一起，但也有個(gè)別材料的聚類關(guān)系與其形態(tài)特征密切相關(guān)，而與其地理起源距離的關(guān)系不甚密切。 6．綜合分析本課題的研究結(jié)果表明：RAPD分子標(biāo)

10、記技術(shù)和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)均可有效地應(yīng)用于木犀科苦丁茶種質(zhì)資源的的遺傳多樣性分析，親緣關(guān)系及分類地位研究，以及種質(zhì)材料的起源地域分析或類群劃分等研究領(lǐng)域。但就實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定性或?qū)嶒?yàn)結(jié)果的可重復(fù)性而言，ISSR標(biāo)記技術(shù)要優(yōu)于RAPD標(biāo)記技術(shù)，且ISSR能揭示更多的多態(tài)性，具有更強(qiáng)的分辯力。Mantel檢測表明，在種間水平和種內(nèi)水平上，這兩種標(biāo)記的分析結(jié)果均呈極顯著的相關(guān)性，r=0.8985（物種間）和r=0．9705（粗壯女貞材料間）。