肺癌抗體靶向治療與新型工程抗體藥物的研究.pdf

1、肺癌是嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤,靶向治療已在臨床肺癌治療中顯示出較傳統(tǒng)化療更令人滿意的療效,已成為目前肺癌研究的熱點。
　　 為了給肺癌的靶向治療提供潛在的新的候選靶標和靶向治療新藥,本研究的第一部分通過制備、篩選、鑒定具有抑制抗肺癌功能的鼠單克隆抗體,再用質(zhì)譜技術(shù)反向鑒定其靶抗原蛋白,發(fā)現(xiàn)了新的肺癌靶向治療靶標MYH9,并研究了該蛋白對于肺癌細胞生長轉(zhuǎn)移的作用和初步機制。采用自行建立的基于功能性單克隆抗體庫和功能差異細胞

2、模型的免疫蛋白質(zhì)組學技術(shù),從含2893個雜交瘤單抗的抗肺癌單克隆抗體庫中篩選出候選的抗肺癌功能性單抗33株。對其中的1株IgGl類的單抗23C2進行了深入的研究。通過活細胞免疫熒光亞細胞結(jié)構(gòu)定位及活細胞流式細胞術(shù)證實單抗23C2所識別的抗原在多種肺癌細胞系中均有表達,并可部分轉(zhuǎn)位于細胞膜表面；對60例肺癌病人癌組織及配對正常組織進行免疫組化檢測的結(jié)果證明,單抗23C2的靶抗原在85％的人肺癌組織中特異性地上調(diào)表達。采用共接種模型進行23

3、C2單抗的體內(nèi)抑瘤實驗,結(jié)果證明23C2單抗可以顯著抑制人肺癌移植瘤的生長,抑瘤率達73.7％。以上結(jié)果表明抗肺癌功能性單抗23C2的靶抗原在肺癌中特異上調(diào)表達,并在肺癌生長中起了重要作用,具有成為肺癌治療靶標的潛力。運用免疫親和層析和MALDI-TOF-PMF質(zhì)譜技術(shù),鑒定23C2單抗所識別的抗原為220KD左右的非肌性肌球蛋白重鏈IIA(NMHC IIA,MYH9)；并進一步采用基因敲降、免疫共沉淀和細胞免疫熒光共定位等多種方法證明

4、了單抗23C2識別的抗原確為MYH9。采用MYH9的商業(yè)化抗體檢測肺癌細胞及120例肺癌及正常組織,結(jié)果顯示MYH9在88.2％的肺癌組織中上調(diào)表達,并可表達于細胞膜上,與單抗23C2的檢測結(jié)果一致。隨后,本研究應用單抗23C2體外處理肺癌細胞和RNAi技術(shù)敲降MYH9基因表達,分析了體外干擾阻斷MYH9對肺癌細胞增殖、黏附、侵襲、遷移以及細胞周期的作用。結(jié)果顯示,單抗23C2阻斷MYH9可抑制肺癌細胞體外生長,抑制率達23.3％；可抑

5、制肺癌細胞遷移,抑制率達23.15％,但對細胞周期、黏附和侵襲均未觀察到明顯的影響。RNAi技術(shù)敲降肺癌細胞A549中MYH9基因的表達后,A549細胞形態(tài)明顯改變；細胞在Matrigel基質(zhì)上的生長受到顯著抑制,抑制率達68.2％；細胞與胞外基質(zhì)FN、Matrigel和CollagenⅠ的黏附能力顯著下降,分別降低22.76％、30.78％、55.12％,細胞體外遷移和侵襲能力顯著下降,分別下降了39％-53％和38.3％。這些研究結(jié)

6、果證明,MYH9在體外具有促進肺癌細胞生長、與胞外基質(zhì)黏附、遷移和侵襲的重要功能。為了進一步探討MYH9促進肺癌細胞生長、黏附、遷移和侵襲的作用機制,檢測了敲降MYH9基因后對A549細胞周期變化的影響,發(fā)現(xiàn)雖然細胞周期無顯著變化,但誘導了A549細胞發(fā)生凋亡,這可能是敲降MYH9基因后A549細胞生長受到顯著抑制的原因之一；同時采用免疫熒光染色技術(shù)發(fā)現(xiàn),敲降MYH9基因后圍繞于A549細胞周邊對于細胞運動非常重要的黏著斑顯著減少,F-

7、actin骨架蛋白排列紊亂,提示MYH9可能參與了黏著斑蛋白復合物的形成,并影響收縮運動微絲的形成,從而促進肺癌細胞的黏附、遷移和侵襲。以上研究結(jié)果表明,MYH9具有作為肺癌靶向治療的一個新的功能性分子靶標的重要潛力。
　　 力達霉素(LDM)是一種超強細胞毒性化療藥物,但同時產(chǎn)生的毒副作用限制了其臨床應用。為此,本研究第二部分首次在真核細胞中構(gòu)建并高效表達了基于LDM的抗體靶向型藥物——抗人CEA小分子抗體融合蛋白,以期克服其

8、毒副作用大的缺陷。采用基因工程重組技術(shù),將抗CEA嵌合抗體Rch24的小分子抗體F(ab’)2重鏈C-末端通過接頭與LDM的輔基蛋白LDP連接,構(gòu)建了Rch24 F(ab’)2-LDP抗體融合蛋白重鏈基因,再將其連接入真核高效表達載體,與原有抗CEA小分子抗體F(ab’)2輕鏈表達載體一起,構(gòu)成了完整的抗人CEA小分子抗體-LDP融合蛋白的真核高效表達載體系統(tǒng)。將輕重鏈表達載體同時導入真核細胞CHO中,經(jīng)MTX3×10-8M加壓后,實現(xiàn)

9、了抗人CEA小分子抗體-LDP融合蛋白的高效表達,產(chǎn)量可達16μg/ml。培養(yǎng)上清中的表達產(chǎn)物經(jīng)Western boltting鑒定具有正確的分子量,直接ELISA檢測證明該抗體融合蛋白具有與CEA抗原結(jié)合的活性,活細胞免疫熒光檢測證明該抗體融合蛋白具有特異與腫瘤細胞膜表面CEA抗原結(jié)合的活性。這些結(jié)果表明我們所獲得的抗體融合蛋白表達產(chǎn)物具有正確的分子結(jié)構(gòu)和良好的生物學活性。
　　 綜上所述,本研究通過制備篩選具有抑制抗肺癌功能

10、的鼠單克隆抗體并反向鑒定其靶抗原蛋白的技術(shù),首次報道發(fā)現(xiàn)了1個新的可表達于細胞膜上,并在人肺癌組織中特異表達的肺癌靶向治療功能性分子靶標MYH9,證明其具有促進肺癌細胞生長、黏附、遷移和侵襲的重要功能,為肺癌靶向治療提供了新的重要候選靶標；首次構(gòu)建了抗人CEA嵌合小分子抗體與力達霉素輔基蛋白的融合蛋白并在真核哺乳動物細胞CHO中實現(xiàn)了高產(chǎn)量表達,表達產(chǎn)物具有良好的生物活性,為肺癌等CEA陽性腫瘤的抗體靶向治療提供了一種高效低毒的新的候選