NF-κB在腦缺血及再灌注早期活性變化及納洛酮的影響.pdf

1、核因子-κB(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，靜息狀態(tài)下通常與其抑制物IκB以無(wú)活性的復(fù)合物形式存在于細(xì)胞胞漿中。腦缺血及再灌注時(shí)，NF-κB可被多種因素激活，但NF-κB在腦缺血及再灌注損傷中的作用還有爭(zhēng)議。目前納洛酮已廣泛用于急性神經(jīng)系統(tǒng)損害的臨床治療，但基礎(chǔ)研究相對(duì)較少，且具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究探討代表NF-κB活性的亞基P65及其抑制物I-κBα在腦缺血及再灌注早期的活性變化，

2、并觀察納洛酮對(duì)其影響及意義。 第一部分小鼠腦缺血再灌注早期NF-κB活性變化及意義目的研究小鼠腦缺血再灌注早期核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的亞基P65及其抑制物I-κBα的mRNA表達(dá)和其蛋白活性及作用。 方法(1)采用小鼠腦缺血再灌注損傷模型，記錄不同時(shí)期小鼠異常神經(jīng)癥狀。 (2)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)期腦組織NF-κBP65亞單位及其抑制因子-κBα(I-κBα)的mRNA表達(dá)。

3、 (3)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)期腦組織NF-κBP65亞單位和I-κBα的蛋白質(zhì)活性變化。 結(jié)果(1)小鼠腦缺血再灌注后30min腦組織NF-κBP65蛋白質(zhì)活性增加，2h達(dá)高峰，24h仍維持較高水平(均P＜0.05)，而NF-κBP65mRNA的表達(dá)在各觀察時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯改變(均P＞0.05)。 (2)小鼠腦組織I-κB-α蛋白質(zhì)活性水平于腦缺血再灌注后30min下降，2h達(dá)最低(均P＜0.05

4、)，以后逐漸恢復(fù)正常，I-κBαmRNA的表達(dá)與其蛋白活性水平相一致(r=0.748；P＜0.05)。 (3)小鼠腦缺血再灌注早期腦組織NF-κBP65蛋白質(zhì)活性變化與小鼠異常神經(jīng)癥狀呈正相關(guān)(r=0.826；P＜0.05)，腦組織I-κBα的蛋白質(zhì)活性及其mRNA的表達(dá)與小鼠異常神經(jīng)癥狀均呈負(fù)相關(guān)(r蛋白=-0.743；rmRNA=-0.667,均P＜0.05)，NF-κBP65與I-κBα的蛋白質(zhì)活性水平負(fù)相關(guān)(r=-0.8

5、20；P＜0.05)。 結(jié)論(1)小鼠腦缺血再灌注早期腦組織中存在NF-κBP65亞單位的激活和其抑制物I-κBα的減少，且以2小時(shí)為最明顯。 (2)NF-κB激活可能參與了腦缺血再灌注早期的損傷過(guò)程。 第二部分納洛酮對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷早期的腦保護(hù)作用及機(jī)制目的探討納洛酮在腦缺血再灌注損傷時(shí)的保護(hù)作用及可能的影響機(jī)制。 方法(1)實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組，實(shí)驗(yàn)(缺血再灌注2h)組和納洛酮預(yù)處理組

6、。記錄小鼠異常神經(jīng)癥狀。 (2)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組小鼠腦組織NF-κBP65亞單位及其抑制因子-κBα(I-κBα)的mRNA表達(dá)。 (3)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠腦組織NF-κBP65亞單位和I-κBα的蛋白質(zhì)活性變化。 結(jié)果(1)小鼠腦缺血再灌注2h組腦組織NF-κBP65蛋白質(zhì)活性水平明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)；納洛酮預(yù)處理組腦組織NF-κBP65蛋白質(zhì)活性水平低于實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)；

7、但納洛酮預(yù)處理組腦組織NF-κBP65蛋白質(zhì)活性水平高于假手術(shù)組(P＜0.05)。三組小鼠腦組織NF-κBP65mRNA的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。 (2)小鼠腦缺血再灌注2h組腦組織I-κBαmRNA的表達(dá)及其蛋白質(zhì)活性水平明顯低于假手術(shù)組(均P＜0.05)，納洛酮預(yù)處理組腦組織I-κBαmRNA的表達(dá)及其蛋白質(zhì)活性水平高于實(shí)驗(yàn)組(均P＜0.05)；但納洛酮預(yù)處理組腦組織I-κBαmRNA的表達(dá)及其蛋白質(zhì)活性水平仍低于

8、假手術(shù)組(P＜0.05)。 (3)小鼠腦缺血再灌注后2h組的小鼠異常神經(jīng)癥狀評(píng)分高于假手術(shù)組(P＜0.05)；納洛酮預(yù)處理組的小鼠異常神經(jīng)癥狀評(píng)分較再灌注后2h組明顯改善(P＜0.05)；但納洛酮預(yù)處理組的小鼠異常神經(jīng)癥狀評(píng)分仍高于假手術(shù)組(P＜0.05)。 結(jié)論納洛酮能降低小鼠腦缺血再灌注早期損傷的腦組織NF-κB活性，這可能是其減輕腦缺血再灌注早期損傷的重要機(jī)制之一。 第三部分急性腦梗塞外周血單核細(xì)胞NF-κ

9、B表達(dá)及納洛酮的影響目的尋找外周血單核細(xì)胞與急性腦缺血損傷的關(guān)系，探討納洛酮對(duì)外周血單核細(xì)胞核因子-κBP65亞基及其抑制物I-κBαmRNA表達(dá)的影響和治療急性腦梗塞的可能又一腦保護(hù)機(jī)制。 方法(1)采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心及貼壁培養(yǎng)法對(duì)21例急性腦梗塞患者和21例單純高血壓者周圍血單核細(xì)胞分離、純化后，分為原液組、納洛酮處理組并培養(yǎng)24小時(shí)。 (2)對(duì)急性腦梗塞患者進(jìn)行臨床神經(jīng)功能缺損評(píng)分。

10、 (3)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組外周血單核細(xì)胞NF-κBP65亞單位及其抑制因子-κBα(I-κBα)的mRNA表達(dá)。 結(jié)果(1)急性腦梗塞組外周血培養(yǎng)的單核細(xì)胞NF-κBP65mRNA的表達(dá)水平高于單純高血壓組(P＜0.05)；而其I-κBαmRNA的表達(dá)低于單純高血壓組(P＜0.05)。在急性腦梗塞患者中，納洛酮處理組的單核細(xì)胞NF-κBP65mRNA的表達(dá)水平低于對(duì)照組(P＜0.05)；而I-κBαmRNA的表達(dá)水平高

11、于對(duì)照組(P＜0.05)。納洛酮對(duì)單純高血壓患者外周血培養(yǎng)的單核細(xì)胞NF-κBP65、I-κBαmRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響(均p＞0.05)。 (2)急性腦梗塞患者外周血單核細(xì)胞NF-κBP65mRNA的表達(dá)水平與其臨床神經(jīng)功能缺損評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.695，P＜0.05)；I-κBαmRNA的表達(dá)水平與其臨床神經(jīng)功能缺損評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.522，P＜0.05)；NF-κBP65mRNA與I-κBαmRNA的表達(dá)水平呈負(fù)

12、相(r=-0.648；P＜0.05)。 結(jié)論(1)急性腦梗塞患者外周血單核細(xì)胞存在NF-κBP65mRNA的表達(dá)增加及其抑制物I-κBαmRNA的表達(dá)降低； (2)外周血單核細(xì)胞源性NF-κB的活性增強(qiáng)可能參與了急性腦梗塞后腦損傷過(guò)程。 (3)納洛酮抑制急性腦梗塞患者外周血單核細(xì)胞NF-κB的活性可能是其治療急性腦梗塞的機(jī)制之一。 (4)納洛酮不能抑制單純高血壓患者外周血單核細(xì)胞NF-κB的活性