肝病患者谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶P1的研究.pdf

1、慢加急性肝衰竭(Acute on chronic liver failure，ACLF)是指在慢性肝病基礎(chǔ)上，短期內(nèi)發(fā)生急性肝功能失代償?shù)闹饕R床表現(xiàn)。常見(jiàn)的病因包括(1)感染因素:嗜肝或非嗜肝病毒、乙型肝炎（顯性或隱性）或丙型肝炎再活動(dòng);(2)非感染因素:有飲酒史、肝毒性藥物（中草藥）、手術(shù)以及自身免疫性肝病等。在我國(guó)，慢加急性肝衰竭主要發(fā)生于慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)基礎(chǔ)上。同時(shí)，乙肝病毒(

2、Hepatitis B virus，HBV)感染又是原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)最主要的致病因素，HCC的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制涉及癌基因、抑癌基因、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及其受體等多個(gè)環(huán)節(jié)，抑癌基因的表達(dá)降低參與了HCC的發(fā)生。
　　 谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶P1(Glutathione S-transferase P1，GSTP1)是人體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要的Ⅱ相代謝酶之一，是細(xì)胞抗氧化損傷、抗癌

3、變的主要解毒酶。GSTP1屬于谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S transferase，GST)家族，該家族是還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)發(fā)揮對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化、保護(hù)肝細(xì)胞膜、清除氧自由基和促進(jìn)肝臟合成功能等作用時(shí)必需的一組催化酶。GSTP1基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化時(shí)，會(huì)使GSTP1的表達(dá)降低，對(duì)肝臟的保護(hù)作用降低，可能會(huì)加重氧化損傷對(duì)肝功能的損害。
　　 本論文通過(guò)檢測(cè)ACLF患者外

4、周血中的GSTP1啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況和氧化損傷狀態(tài)以及肝癌患者的GSTP1蛋白和mRNA表達(dá)情況，來(lái)研究GSTP1在ACLF和HCC發(fā)生中所發(fā)揮的作用。
　　 第一部分谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶P1啟動(dòng)子區(qū)甲基化與慢加急性肝衰竭患者氧化損傷的相關(guān)性研究
　　 肝衰竭是多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損害，導(dǎo)致其合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙或失代償，出現(xiàn)以凝血機(jī)制障礙和黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群。根據(jù)病

5、理組織學(xué)特征和病情發(fā)展速度，肝衰竭可被分為四類:急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)、亞急性肝衰竭(subacute liver failure，SA)、慢加急性肝衰竭Acute on chronic liverfailure，ACLF)和慢性肝衰竭(chronic liver failure，CLF)。慢加急性肝衰竭是指在慢性肝病基礎(chǔ)上，短期內(nèi)發(fā)生急性肝功能失代償?shù)闹饕R床表現(xiàn)。常見(jiàn)的病因包括感染因素:嗜肝或非

6、嗜肝病毒、乙型肝炎（顯性或隱性）或丙型肝炎再活動(dòng);非感染因素:有飲酒史、肝毒性藥物（中草藥）、手術(shù)以及自身免疫性肝病等。在我國(guó)，慢加急性肝衰竭主要發(fā)生于慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)患者。除病毒性肝炎外，常見(jiàn)的肝衰竭病因還有妊娠急性脂肪肝、藥物性肝病和酒精性肝病。
　　 谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶P1(Glutathione S-transferase P1，GSTP1)是人體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要的Ⅱ相

7、代謝酶之一，是細(xì)胞抗氧化損傷、抗癌變的主要解毒酶。GSTP1屬于谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)家族，該家族是還原型谷胱甘肽(GSH)發(fā)揮對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化、保護(hù)肝細(xì)胞膜、清除氧自由基和促進(jìn)肝臟合成功能等作用時(shí)必需的一組催化酶。GSTP1基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化時(shí)，會(huì)使GSTP1的表達(dá)降低，對(duì)肝臟的保護(hù)作用降低，可能會(huì)加重氧化損傷對(duì)肝功能的損害。GSTP1基因啟動(dòng)子甲基化在各種腫瘤中研究較多，如肝癌，前列腺癌等。但慢加急性肝衰竭患者中是否存在GS

8、TP1啟動(dòng)子區(qū)甲基化的情況及其與氧化損傷的相關(guān)性尚未有研究。
　　 目的:
　　 在本研究中，我們致力于分析乙肝病毒感染相關(guān)的ACLF患者的GSTP1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)和氧化損傷水平，并與慢性乙型病毒性肝炎患者進(jìn)行比較，觀察GSTP1甲基化是否ACLF的發(fā)生及氧化損傷水平具有相關(guān)性以及評(píng)價(jià)它們的相關(guān)性。
　　 方法:
　　 1.收集10例正常人、48例ACLF患者和48例CHB患者外周血5ml，密度梯

9、度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞和血清，用試劑盒提取單個(gè)核細(xì)胞中的基因組DNA。
　　 2.DNA甲基化修飾試劑盒處理DNA將DNA分子中的未甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)。甲基化特異性PCR(MSP-PCR)法檢測(cè)外周血中GSTP1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況。采用文獻(xiàn)的引物并采用其PCR條件，凝膠電泳檢測(cè)所得產(chǎn)物。
　　 3.采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantita

10、tive PCR，QRT-PCR)的方法來(lái)檢測(cè)ACLF患者和CHB患者外周血中的GSTP1的mRNA表達(dá)水平。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)來(lái)測(cè)定HCC患者和CHB患者血清中的丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量，其中，MDA的血清水平含量代表氧化損傷的水平，GSH的水平代表患者血清的抗氧化損傷水平。
　　 結(jié)果:
　　 48例ACLF患者中

11、有13例，48例CHB患者中有4例(8.57％)，檢測(cè)到GSTP1甲基化，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=5.79，P=0.03)，提示GSTP1甲基化可能參與CHB患者進(jìn)展為ACLF。ACLF患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的GSTP1 rnRNA表達(dá)水平較CHB患者的表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)。ACLF患者中GSTP1甲基化組的GSTP1 mRNA表達(dá)水平較非甲基化組明顯降低(P=0.01)。ACLF患者中GSTP1甲基化組和非甲基化組之間的臨

12、床指標(biāo)如ALT、AST、PTA之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但甲基化組的TBIL水平明顯高于非甲基化組(P=0.04)。ACLF患者血清中的MDA水平較CHB患者的水平明顯升高(0.68±0.3 ng/ml vs0.42±0.18 ng/ml，P=0.02)，ACLF患者血清中的GSH的水平較CHB患者的水平明顯降低(0.68±0.3ng/ml vs0.42±0.18 ng/ml，P=0.02)。ACLF患者中GSTP1甲基化組的

13、MDA水平也明顯高于非甲基化組(14.45±6.23 pmol/mg vs11.76±3.94 pmol/mg，P=0.04)，兩組患者的GSH水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。ACLF患者中GSTP1甲基化組和非甲基化組之間的病情程度（MELD積分）沒(méi)有顯著差別(20.32±4.72 vs18.57±5.19，P=0.35)。MDA水平與MELD積分之間存在正相關(guān)(r=0.579，P＜0.01)，即氧化損傷程度與ACLF患者的病情嚴(yán)重程度成正相

14、關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 GSTP1基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化參與了氧化損傷對(duì)ACLF患者的肝功能損害，并且氧化損傷程度與患者的病情嚴(yán)重程度成正相關(guān)。
　　 第二部分肝癌患者與慢性乙型病毒性肝炎患者外周血中的GSTP1表達(dá)水平和氧化損傷狀態(tài)的比較
　　 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染與急慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。我國(guó)的原發(fā)性肝癌(hepatocel

15、lular carcinoma，HCC)主要發(fā)生于慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)的基礎(chǔ)上。肝癌的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制涉及癌基因、抑癌基因、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及其受體等多個(gè)環(huán)節(jié)。既往多項(xiàng)研究顯示肝癌的發(fā)生與某些抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化相關(guān)，如凋亡相關(guān)基因、p16基因、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子激活劑抑制因子等，這些基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化會(huì)導(dǎo)致抑癌基因的表達(dá)減少，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生和進(jìn)展。
　　 谷胱甘肽巰

16、基轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)是人體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要的Ⅱ相代謝酶之一，是細(xì)胞抗損傷、抗癌變的主要解毒系統(tǒng)。以往的研究表明多種腫瘤患者體內(nèi)GSTP1的表達(dá)水平存在明顯異常。例如，在前列腺癌、胃癌以及肝細(xì)胞肝癌中研究者發(fā)現(xiàn)存在GSTP1的啟動(dòng)子區(qū)甲基化，由基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化導(dǎo)致的表達(dá)量減少可能參與了上述腫瘤的發(fā)生，但GSTP1蛋白表達(dá)水平的改變以及肝癌患者的氧化損傷狀態(tài)研究較少。
　　 目的:
　　 在本研究中，我們致力于分析乙

17、肝病毒相關(guān)的肝癌患者的GSTP1蛋白表達(dá)水平、mRNA表達(dá)水平以及氧化損傷狀態(tài)，并與慢性乙型病毒性肝炎患者進(jìn)行比較，觀察GSTP1的表達(dá)水平以及氧化損傷狀態(tài)是否與肝癌的發(fā)生具有相關(guān)性。
　　 方法:
　　 我們首次采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)的方法來(lái)測(cè)定38例乙肝病毒相關(guān)肝癌(HCC)患者和38例CHB患者以及10名健康對(duì)照者外周血中的GSTP1的表達(dá)水平。采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescence

18、 quantitative PCR，QRT-PCR)的方法來(lái)檢測(cè)HCC患者和CHB患者外周血中的GSTP1的mRNA表達(dá)水平。采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)來(lái)測(cè)定HCC患者和CHB患者血清中的丙二醛(MDA)和黃嘌呤氧化酶(XOD)，還原型谷胱甘肽(GSH)以及谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)含量，其中，MDA和XOD的血清水平含量代表氧化損傷的水平，GSH和GST的水平

19、代表患者血清的抗氧化損傷水平。
　　 結(jié)果:
　　 乙肝病毒相關(guān)的HCC患者外周血中的GSTP1蛋白表達(dá)水平較CHB患者水平明顯降低(陽(yáng)性百分率1.13±0.55％ vs2.72±1.06％，P=0.005;平均熒光強(qiáng)度2.63±1.02 vs5.63±2.33，P=0.002)。與GSTP1蛋白表達(dá)水平的變化相似，HCC患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的GSTP1的mRNA表達(dá)水平較CHB患者的表達(dá)水平明顯降低(中位數(shù):0.04

20、;范圍:0.005-0.33 vs.中位數(shù):0.06;范圍:0.02-1.05; P=0.01)。 HCC患者血清中的MDA和XOD水平較CHB患者的水平明顯升高(19.13±2.01 pmol/mgvs12.99±3.55 pmol/mg, P=0.006;183.23±78.09 mIU/ml vs53.96±29.28mIU/ml,P＜0.01)，HCC患者血清中的GSH和GST的水平較CHB患者的水平明顯降低(2.81±1.40