家兔全卵巢移植所致缺血對卵泡早期生存狀態(tài)影響的研究.pdf

1、目的：
　　隨著醫(yī)療診斷及治療技術的提升，癌癥患者的生存率不斷提高。但仍舊日存在一個問題，放化療對卵巢造成的不可逆損害，使得年輕女性出現(xiàn)卵巢早衰(POF)及生育能力嚴重受損。其中經過細胞毒藥物烷化劑、腹部放射治療的癌癥女性患者發(fā)生卵巢早衰后不孕的概率接近100％[1]。目前生殖能力保存方式有胚胎冷凍移植，卵母細胞冷凍移植，卵巢皮質片冷凍移植，全卵巢冷凍移植[2]。其中全卵巢冷凍移植是目前保存生殖能力令人振奮又最具挑戰(zhàn)的技術之一。缺

2、血是導致長期移植過程卵泡大量丟失的首要因素[1]，使得全卵巢移植仍舊不理想。短時缺血對移植早期的卵泡生存狀態(tài)的影響研究較少。故本實驗旨在通過建立家兔新鮮全卵巢移植模型，探討短時缺血在移植早期對卵泡生存狀態(tài)的影響，摸索卵泡早期卵泡生存狀態(tài)的變化，從而為以后全卵巢冷凍和移植降低缺血影響提供早期干預參考及實驗基礎。
　　方法：
　　20只5月齡性成熟的日本大耳白兔(2.0-2.5kg)，經麻醉后實施雙側卵巢切除術。右側卵巢做為左側

3、卵巢的新鮮對照。左側卵巢經預冷的肝素鈉溶液(100IU/ml)灌注15min后，將左側卵巢移植至對側，左卵巢動脈與右側卵巢動脈殘端以端端吻合方式間斷吻合，左卵巢靜脈與右側卵巢靜脈殘端以端端吻合方式連續(xù)吻合，均在×20視野下進行。整個移植過程控制在30min內完成。卵巢皮質的泛紅及動脈搏動良好是評判移植后血循環(huán)通暢的指標。之后分別在移植后1天(1D，n=4)，3天(3D，n=4)，1周(1W，n=4)，2周(2W，n=4)，1月(1M，n

4、=4)取出移植卵巢，行石蠟包埋HE染色光鏡下形態(tài)學分析，免疫組化PCNA(proliferating cell nuclear antigen)及雙色熒光GLI及Patched(Hedgehogsignaling pathway)檢測卵泡增殖情況，TUNEL分析檢測卵泡凋亡情況，實時熒光PCR半定量PCNA，GLI，Patched，Bcl-2，Bax，Caspase-3基因的表達。
　　結果：
　　一.組織學檢查
　　

5、各組的移植后卵巢組織均可觀察到形態(tài)正常的各級卵泡，包括原始卵泡，初級卵泡，次級卵泡等。與每只卵巢對側新鮮比較，移植后各組卵泡總正常率(THR)及各級卵泡正常率(HR)無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。但每組對側新鮮卵巢卵泡總正常率與移植后卵泡總正常率差值(D-value)隨著移植時間推移呈現(xiàn)有意義上升的趨勢(P＜0.05)。其中，1D組的D-value顯著低于1M組(7.05±0.65 vs.17.30±1.87，P＜0.05)。同時，D-

6、value在1D組和3D組之間，1W組和2W組之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　二.PCNA的表達
　　各組移植后卵巢組織均可觀察到PCNA的表達，原始卵泡少量表達，初級以上卵泡大量表達。移植各組原始及初級卵泡陽性表達率分別與其對側新鮮比較均無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。同時，1D組的原始及初級卵泡陽性表達率與3D組相似（P＞0.05），但從第7天開始，原始卵泡陽性表達率顯著高于1D及3D組（P＜0.05），而初級

7、卵泡陽性表達率相比1D及3D組呈現(xiàn)顯著的降低(P＜0.05)。1W，2W，1M組原始卵泡及初級卵泡陽性表達率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　三.TUNEL分析
　　各移植組及新鮮卵巢組織（新鮮組:1244顆卵泡，1D組:789顆卵泡，3D組:1006顆卵泡，1W組:624顆卵泡，2W組:693顆卵泡，1M組:654顆卵泡）均極少觀察到TUNEL的陽性表達。其中，TUNEL陽性細胞主要分布在竇卵泡及早期閉鎖卵泡，偶爾可觀察

8、到小卵泡陽性表達。在計數(shù)的陽性大卵泡中，各組陽性表達率均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　四.免疫雙色熒光檢測Patched和GLI的表達
　　移植后各組卵巢組織均觀察到有Patched和GLI的陽性表達，在各級卵泡的卵泡漿內或顆粒細胞漿內呈現(xiàn)紅色、綠色熒光，但新鮮組呈陰性。同時各組熒光信號強度相當。
　　五.各基因的mRNA的表達
　　移植后各組PCNA的mRNA的表達呈現(xiàn)有意義的下降趨勢(P＜0.05)，其

9、中1D組PCNA的mRNA表達與3D組無差異(P＞0.05)，這與免疫組化結果一致。同時移植后各組卵巢Patched和GLI的mRNA表達無明顯差異(P＞0.05)，這與免疫雙色熒光結果一致。并且移植后各組在凋亡基因Caspase-3，Bax/Bcl-2的mRNA表達上仍舊無明顯差異(P＞0.05)。
　　結論：
　　1.移植各組無論在形態(tài)學，增殖，凋亡方面與其對側新鮮比較均無顯著統(tǒng)計學差異，充分表明全卵巢移植所致短時缺血在

10、早期對卵泡生存狀態(tài)的影響甚小，至少1月內是如此。另外充分證明了本實驗的全卵巢移植血管吻合技術的建立和應用是可行的。
　　2.移植各組組間比較發(fā)現(xiàn)隨著移植時間推移，卵泡總正常率呈現(xiàn)下降趨勢，逐漸出現(xiàn)卵泡異常數(shù)量增加;原始卵泡PCNA的表達呈現(xiàn)上升的趨勢，表明缺血缺氧同時也刺激了原始卵泡的增殖。
　　3.無論從組織學檢查還是PCNA表達均發(fā)現(xiàn)1W組的卵泡正常率及原始卵泡的陽性表達率均與1D組和3D組有顯著差異，表明7天后缺血對卵

11、泡影響逐漸顯現(xiàn)，7天是移植的一個關鍵時間點。在7天內對移植進行干預（藥物干預）有可能降低缺血對卵泡生存的影響。
　　4.免疫雙色熒光檢測Patched和GLI的表達發(fā)現(xiàn)移植各組均有Patched、GLI的表達，而新鮮對照組呈陰性。同時實時熒光PCR顯示移植各組Patched、GLImRNA的表達無明顯差異，表明移植過程中Hedgehog通路被激活，也許是應對缺血對卵泡損害的一種保護機制。
　　5.本研究所建立的卵巢血管吻合移