抑制UPP對(duì)豬配子泛素化水平及精卵結(jié)合能力的影響.pdf

1、豬體外受精(In vitro fertilization，IVF)過程中容易發(fā)生多精入卵現(xiàn)象，導(dǎo)致豬胚胎發(fā)育率和產(chǎn)子率降低。有研究表明泛素蛋白酶體途徑(UbiquitinProteasome Pathway，UPP)在海鞘類和哺乳類IVF過程中具有重要的作用，在精卵結(jié)合時(shí)能夠降解透明帶(Zona pellucida，ZP)蛋白，幫助精子穿透ZP，從而成功受精。UPP是生物體內(nèi)主要的蛋白質(zhì)降解途徑，依賴ATP提供能量，具有調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和

2、降解錯(cuò)誤折疊與多余蛋白的作用，與人類的基因遺傳疾病、癌癥、腫瘤、神經(jīng)疾病等多種疾病有關(guān)。其主要的執(zhí)行過程被稱為Ub降解途徑，受泛素激活酶(Ubiquitin activating Enzyme，E1)、E2酶、E3酶和去泛素化(deubiquitination，DUBs)酶調(diào)控，也有研究表明UPP途徑對(duì)精子發(fā)生和卵母細(xì)胞發(fā)生也具有十分重要的作用，但是到目前為止，在豬IVF的兩個(gè)配子形成過程中Ub蛋白的來源及精卵結(jié)合過程中Ub的作用尚不十

3、分明確。因此，本試驗(yàn)中研究了成熟精子、成熟精子對(duì)應(yīng)的精清、未成熟精子和未成熟精子對(duì)應(yīng)的精清中Ub蛋白含量，不同直徑卵泡液中Ub蛋白含量及卵母細(xì)胞成熟情況，并在卵母細(xì)胞培養(yǎng)液與IVF液中添加ATP循環(huán)產(chǎn)物無機(jī)磷酸鹽(Inorganic phosphate，PPi)、E2和DUBs抑制劑，檢測其對(duì)精子獲能、頂體反應(yīng)(acrosome reaction，AR)的Ub程度的影響，和對(duì)卵母細(xì)胞成熟率、Ub程度及多精入卵的影響。檢測不同時(shí)期的黃體與

4、卵丘顆粒細(xì)胞中的Ub蛋白含量，并在豬精子保存液中添加PPi檢測其對(duì)精子生物學(xué)指標(biāo)及與泛素相關(guān)的蛋白的影響。結(jié)果表明:
　　(1)在豬精子保存液中添加濃度為50μM的PPi能夠在保存過程中顯著地提高精子的生物學(xué)指標(biāo)及Ub、頂體酶抑制劑（acrosin inhibitor，AI）、PSMD4蛋白的含量(P＜0.05);
　　(2)成熟精子中的Ub蛋白含量顯著地高于未成熟精子和成熟精子對(duì)應(yīng)的精清(P＜0.05)，未成熟精子對(duì)應(yīng)的精

5、清中不含Ub蛋白，直徑為3～6 mm的卵泡的卵泡液中Ub含量顯著地高于直徑為1～3和6mm以上組(P＜0.05)，中期黃體中Ub蛋白含量顯著地高于早期和晚期黃體(P＜0.05)，卵丘細(xì)胞中含有Ub蛋白;
　　(3)在豬精子獲能液中分別添加不同濃度的E2和DUBs抑制劑，分別當(dāng)濃度達(dá)到10μM時(shí)能夠顯著地降低Ub蛋白、AI蛋白和PSMD4蛋白的含量(P＜0.05);
　　(4)不同直徑卵泡液中的卵母細(xì)胞成熟后，有3條明顯的條帶

6、，且直徑是3～6mm的卵泡中卵母細(xì)胞成熟率與Ub水平顯著地高于其他兩組(P＜0.05)，在豬卵母細(xì)胞IVM液中分別添加不同濃度的PPi、E2和DUBs抑制劑，濃度為1μg/mL的PPi能夠顯著地提高卵母細(xì)胞的成熟率(P＜0.05)，但是其Ub蛋白含量顯著地低于對(duì)照組和其他處理組，添加10μM的E2抑制劑能夠顯著地降低卵母細(xì)胞成熟率和Ub蛋白含量(P＜0.05)，且隨著濃度增加卵母細(xì)胞成熟率與Ub蛋白含量逐漸降低，添加10μM的DUBs抑

7、制劑能夠顯著地降低卵母細(xì)胞成熟率和Ub蛋白含量(P＜0.05)，且隨著濃度增加卵母細(xì)胞成熟率與Ub蛋白含量逐漸降低;
　　(5)在豬IVF液中添加不同濃度的PPi、E2和DUBs抑制劑，濃度為1μg/mL的PPi能夠顯著地增加ZP硬化時(shí)間(P＜0.05)，顯著地降低精子多精入卵率(P＜0.05)，添加濃度為10μM的E2抑制劑能夠顯著地增加ZP硬化時(shí)間(P＜0.05)，顯著地降低精子多精入卵率(P＜0.05)，添加濃度為10μM的

8、DUBs抑制劑能夠顯著地增加ZP硬化時(shí)間(P＜0.05)，顯著地降低精子多精入卵率(P＜0.05)。
　　因此，添加濃度為50μM的PPi在精子保存液中能夠顯著地提高精子的保存效率，濃度為10μM的E2和DUBs抑制劑能夠顯著地降低精子獲能和AR后的Ub和AI蛋白含量，濃度為1μg/mL的PPi能夠顯著地增加卵母細(xì)胞成熟率、顯著地降低Ub蛋白含量及多精入卵率，濃度為10μM的E2和DUBs抑制劑能夠顯著地降低卵母細(xì)胞成熟率、顯著地