ATP7B重組真核表達(dá)質(zhì)粒治療TX小鼠的實(shí)驗(yàn)研究及Ad-ATP7B的構(gòu)建.pdf

1、Wilson病(Wilson'sdisease，WD)，又稱為肝豆?fàn)詈俗冃?hepatolenticulardegeneration，HLD)，是一種常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙疾病。由于銅離子在體內(nèi)蓄積造成肝臟和腦部為主的全身性病理損害。導(dǎo)致以肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主的復(fù)雜的臨床表現(xiàn)，以角膜色素環(huán)(Kayser-Fleischerring，K-F環(huán))最具特征性。其生化特征是血清銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin，CP)降低和膽道排銅障

2、礙。 WD是一種單基因遺傳病，據(jù)本科門診統(tǒng)計(jì)該病位居單基因遺傳病的第二位。WD致病基因定位于D13q14.3，外顯子全長為4398bp,編碼蛋白為P型ATP酶，多肽鏈長1465AA，命名為ATP7B?，F(xiàn)已明確WD基因全長約80Kb，含21個(gè)外顯子及20個(gè)內(nèi)含子。 目前WD的治療方法包括：①金屬絡(luò)合劑為主的驅(qū)銅對(duì)癥治療，②鋅劑治療，③肝移植尤其原位肝移植治療。但這些治療方法均不甚理想，而WD作為單基因遺傳病，最理想的治療當(dāng)

3、屬基因治療。基因治療是指以遺傳學(xué)原理及基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)，在基因水平修補(bǔ)，矯正，替代缺陷基因或調(diào)控其表達(dá)的治療方法。目前應(yīng)用較多的單基因遺傳病基因治療載體是真核表達(dá)質(zhì)粒和病毒載體。真核表達(dá)質(zhì)粒具有構(gòu)建相對(duì)簡單，可在細(xì)菌內(nèi)快速大量擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)。腺病毒載體進(jìn)入宿主細(xì)胞核后以附加體形式存在，不整合進(jìn)宿主基因組，不存在隨機(jī)插入的不安全性問題，同時(shí)又能高效表達(dá)，故WD基因治療應(yīng)用腺病毒載體或真核表達(dá)質(zhì)粒較為合適。國內(nèi)尚未開展WD的基因治療研究。

4、 Wilson病是我國單基因神經(jīng)遺傳病研究得最深入的幾個(gè)病種之一。本課題組在梁秀齡教授帶領(lǐng)下于二十世紀(jì)八十年代初開始了對(duì)WD的系列研究。并首次在國內(nèi)引進(jìn)了目前常用的WD的動(dòng)物模型-TX小鼠，該小鼠的遺傳背景已明確：其致病基因?yàn)閍tp7b，定位于第8號(hào)染色體，突變形式為Mel1356Val，該位點(diǎn)在第8跨膜區(qū)，其mRNA轉(zhuǎn)錄水平無明顯改變。編碼蛋白與人ATP7B蛋白的同源性為58％。也表現(xiàn)為肝內(nèi)銅大量沉積、血清銅和銅藍(lán)蛋白水平下降等。

5、 本研究的目的和意義目前對(duì)WD的治療采用青霉胺等金屬絡(luò)合劑、鋅劑、低銅飲食等對(duì)癥治療，減少銅的攝入并促進(jìn)其排出。由于這些只是對(duì)癥治療，故患者須終生治療，且青霉胺等金屬絡(luò)合劑常出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作用而使患者被迫中斷治療。而原位肝移植治療由于存在難以避免強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)，供肝來源有限，治療費(fèi)用昂貴等諸多問題，只能解決部分患者的治療問題。WD致病基因ATP7B的定位和克隆為WD的基因治療奠定了初步的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)在本課題組既往研究的基礎(chǔ)上

6、，在國內(nèi)率先開展WD基因治療的初步研究和探討。鑒于ATP7BcDNA長達(dá)4.4kb，構(gòu)建重組腺病毒難度較大，故先構(gòu)建ATP7B重組真核表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行離體和在體水平的基因治療研究探索，然后進(jìn)行重組腺病毒的構(gòu)建，為下一步重組腺病毒的基因治療創(chuàng)造條件。內(nèi)容包括： 1.構(gòu)建ATP7B基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/ATP7B。 2.進(jìn)行TX小鼠體外皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)并進(jìn)行pcDNA3.1(+)/ATP7B在細(xì)胞水

7、平基因治療的初步研究。 3.以重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0/ATP7B進(jìn)行TX小鼠基因治療的初步研究。4.構(gòu)建ATP7B基因的重組腺病毒載體Ad-ATP7B。 第一章重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/ATP7B的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)方法 將pRC/CMV-ATP7B和pcDNA3.1(+)以XbaI和BamHI雙酶切后的ATP7BcDNA片段和線性化的pcDNA3.1(+)連接，定向克隆構(gòu)建pcDNA3.1(+)/

8、ATP7B。挑取陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定。并進(jìn)行ATP7BcDNA的全序列測序。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果PCR及酶切鑒定均證實(shí)重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/ATP7B的構(gòu)建成功。ATP7BcDNA的全序列測序發(fā)現(xiàn)3個(gè)錯(cuò)義突變點(diǎn)，但造成的氨基酸改變不在ATP7B蛋白的高度保守區(qū)。 結(jié)論本研究對(duì)重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/ATP7B的構(gòu)建獲得成功。第二章pcDNA3.1(+)/ATP7B對(duì)TX小鼠成纖維細(xì)胞模

9、型銅代謝影響實(shí)驗(yàn)方法 先隨機(jī)選取4月齡的TX小鼠(WD動(dòng)物模型)和DL小鼠(正常對(duì)照小鼠)各10只，雌雄比例相同。以腹部皮膚進(jìn)行成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)，測定其銅/蛋白比值(Cu/p，ng/mg)以確定TX小鼠體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞是否可作為WD細(xì)胞模型。 pcDNA3.1(+)/ATP7B瞬時(shí)轉(zhuǎn)染TX小鼠體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，確定pcDNA3.1(+)/ATP7B的最適加入量和加入后細(xì)胞最佳收集時(shí)間。 再隨機(jī)選取4月

10、齡的TX小鼠20只，將其體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞平行分成3組，一組加生理鹽水，另兩組分別加入pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)/ATP7B。分別測定細(xì)胞Cu/P比值。 以TX小鼠體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞制備細(xì)胞玻片，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/ATP7B24h后取出玻片進(jìn)行細(xì)胞免疫組化實(shí)驗(yàn)，以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒者為對(duì)照組。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果10只TX小鼠和DL小鼠體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)銅蛋白比值(C

11、u/P)分別為(x±S)：(64.25±21.43)ng/mg、(38.43±16.24)ng/mg。前者明顯高于后者，二者相比較有顯著性差異(組間比較t=3.154，P＜0.01)，故TX小鼠的體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞可作為WD的細(xì)胞模型。 pcDNA3.1(+)/ATP7B瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，加入1μgpcDNA3.1(+)/APT7B于24h收集細(xì)胞療效較佳。 TX小鼠體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞加入pcDNA3.1(+)/ATP7B后

12、，Cu/P比值較對(duì)照組顯著下降，P＜0.01。 細(xì)胞免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/ATP7B者表達(dá)ATP7B蛋白較轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)和未轉(zhuǎn)質(zhì)粒者表達(dá)顯著增強(qiáng)，陽性細(xì)胞的胞膜呈棕褐色。結(jié)論 TX小鼠離體培養(yǎng)成纖維細(xì)胞可作為WD的細(xì)胞模型。重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/ATP7B瞬時(shí)轉(zhuǎn)染TX小鼠離體培養(yǎng)成纖維細(xì)胞后能夠表達(dá)并具有排銅作用。 第三章pcDNA3.0/ATP7B對(duì)TX小鼠

13、肝銅代謝和肝功能的影響實(shí)驗(yàn)方法由于本課題研究中所構(gòu)建的pcDNA3.1(+)/APT7B經(jīng)對(duì)APT7BcDNA全序列測序發(fā)現(xiàn)3個(gè)錯(cuò)義突變點(diǎn)，為進(jìn)一步保證研究的結(jié)果可靠性，本實(shí)驗(yàn)中采用了另一種ATP7B重組真核表達(dá)質(zhì)粒(其APT7BcDNA序列正確)進(jìn)行TX小鼠的基因治療研究。 本研究采用質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合后進(jìn)行尾靜脈注射的方式。分別給予pcDNA3.0/APT7B0、10、20、50、100、150μg，3d后測定其肝銅含量(ng

14、/mg，即每mg干重的肝組織中銅的含量)，確定合適的治療的劑量。 然后隨機(jī)選取36只TX小鼠，隨機(jī)分成3組，即注射生理鹽水組、注射pcDNA3.0組、注射pcDNA3.0/ATP7B組。進(jìn)行肝臟組織RT-PCR、Westernblot檢測及肝銅含量測定。取血進(jìn)行肝功能ALT測定。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取100μg/只為治療劑量。RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示，加入pcDNA3.0/ATP7B組于加入后第

15、3、7、14d均可見陽性條帶。但以加入第3d時(shí)最明顯。加入生理鹽水組和加入pcDNA3.0質(zhì)粒組均未見陽性條帶。加入pcDNA3.0/APT7B組與生理鹽水組及pcDNA3.0組比較，于加入第3、7d肝銅含量和ALT均顯著下降，P值＜0.05，以第3天下降最明顯。加入第14d肝銅含量無顯著下降，P值＞0.05；ALT顯著下降，P值＜0.05。 結(jié)論ATP7B基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0/ATP7B對(duì)TX小鼠的銅代謝有改善

16、作用。 第四章重組腺病毒載體Ad-ATP7B的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)方法分別以BamHⅠ+SalⅠ雙酶切pcDNA3.0/ATP7B和pDC315，將ATP7BcDNA目的基因片段和線性化的pDC315連接，定向克隆構(gòu)建pDC315/ATP7B，以PCR和酶切鑒定。pDC315/ATP7B與腺病毒骨架共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞構(gòu)建Ad-ATP7B，PCR進(jìn)行鑒定。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)PCR和酶切鑒定證實(shí)pDC315/ATP7B構(gòu)建成功。pDC315/A

17、TP7B與腺病毒骨架共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后見明顯的毒斑，說明二者在293細(xì)胞中同源重組并包裝成功。經(jīng)PCR證實(shí)重組腺病毒載體Ad-ATP7B構(gòu)建已完成。 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了ATP7B外源目的基因序列完全正確的重組腺病毒載體Ad-ATP7B。 創(chuàng)新點(diǎn)1.首次構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/ATP7B，并以其轉(zhuǎn)染TX小鼠體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞在細(xì)胞水平進(jìn)行WD基因治療研究。 2.首次以重組真核表達(dá)載體p