HPA對臍血來源EPC體外管樣結構形成、增值及遷移能力影響的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 卵巢癌發(fā)病率占婦科惡性腫瘤的46%，因其具有起病隱匿、易轉移、復發(fā)快、臨床治療效果差、5年生存率低等特點。目前，已經嚴重威脅婦女生命和健康的[1-2]，其早期診斷和有效治療已成為臨床診療的瓶頸。隨著逐步對惡性腫瘤侵襲和轉移機制的認識，現(xiàn)已證實卵巢癌中有著活躍的血管生成，并對其發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移及轉歸等方面起著重要作用。從骨髓、臍血或外周血分離出來的內皮組細胞(endothelial progenitor c

2、ell，EPC)能夠在趨化因子和生長因子等刺激下募集，歸巢于腫瘤血管新生位點，促進微血管床芽生，參與腫瘤血管生成。越來越多的研究證實，EPC在腫瘤新生血管的形成中起著重要的作用，參與腫瘤血管的發(fā)生、發(fā)展，并促進腫瘤的生長、侵潤和轉移。并發(fā)現(xiàn)由腫瘤分泌的諸如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等生長因子，不僅局部起作用，而且可以動員從骨髓來源的EPC，定居于血管床。在對胰島素瘤

3、的研究中發(fā)現(xiàn)，骨髓來源EPC參與腫瘤新生血管床的生成[3]。在研究膠質瘤中也證實了腫瘤細胞大量分泌VEGF，促進EPC定居于瘤床，并促進其分化參與管道形成的同時，也對腫瘤細胞的自我更新、分化產生一定的影響[4]。在早期肝癌中，骨髓來源的EPC占腫瘤新生血管內皮的6%，而在晚期肝癌中可達27%，并證實在腫瘤血管生成過程中，存在EPC的參與[5]。
　　 乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是參與降解惡性腫瘤細胞外基質和基底膜

4、的關鍵功能酶之一，能夠促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。隨著國內外研究的進展，人們對HPA認識的深入，發(fā)現(xiàn)HPA在卵巢惡性腫瘤組織中的表達明顯高于卵巢正常組織，并隨腫瘤惡性程度及分期的升高其表達水平呈增高趨勢；并證實卵巢癌組織中HPA的表達隨著VEGF表達的增強則增高，提示HPA通過釋放、激活VEGF來促進腫瘤血管生成。故推測，在惡性腫瘤中，腫瘤細胞與EPC之間構成的微環(huán)境可能存在著相互作用，這種作用可能是雙向的：微環(huán)境中血管性細胞支持癌細胞的

5、分化和更新，而癌細胞同時具有維持微環(huán)境細胞的作用。因此在卵巢癌中可能同樣存在這種微環(huán)境-niches，當有腫瘤細胞釋放多種細胞因子，與EPC之間產生相互作用，以促進腫瘤血管生成。鑒于我們在前期試驗中已經證實人卵巢癌組織中HPA的表達與腫瘤侵襲、轉移、臨床分期和微血管密度等有關[6]；且HPA在人卵巢癌skov3細胞中的高表達[7]。此次實驗研究針對EPC與卵巢癌細胞之間可能存在一種微環(huán)境，卵巢癌細胞分泌的HPA能否促進EPC體外管腔形成

6、這一現(xiàn)象進行研究，并進一步研究其對EPC增值、遷移能力的影響。
　　 基于既往研究結果，提出卵巢癌中存在“腫瘤細胞和EPC共處壁龕(tumor cell-endothelial progenitor cell niches，T-E niches)”的假說，推測腫瘤細胞分泌細胞因子或酶與EPC之間相互作用，促進腫瘤血管生成，并促進腫瘤細胞的演進、復發(fā)和轉移。
　　 目的：
　　 闡明卵巢癌skov3細胞分泌的HPA

7、對臍血來源的EPC體外管養(yǎng)結構形成及其增值、遷移能力的影響，探討卵巢癌細胞與EPC之間相互作用的具體機制。
　　 方法：
　　 1.采用密度梯度離心法分離臍血來源的單核細胞，使用含10%或20%FBS的EGM-2培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)至第5-14d，獲得較均一、貼壁狀態(tài)好、生長旺盛的EPC。采用激光共聚焦檢測其吞噬Dil-acLDL和結合FITC-UEA-1的能力(雙熒光染色檢測)；并采用流式細胞技術檢測其細胞表面表達CD34、

8、CD133、VEGFR-2，以此共同鑒定臍血來源的EPC。
　　 2.構建HPA-ShRNA慢病毒顆粒轉染人卵巢癌skov3細胞，抑制其HPA的表達；并采用real-time PCR、Western blot分別檢測卵巢癌細胞分泌HPA的基因和蛋白表達水平，驗證阻斷效應。并篩選出沉默效果最佳干擾序列的細胞穩(wěn)定傳代后，收集阻斷分泌HPA前、后的細胞上清液，采用ELISA檢測其中分泌的HPA表達水平。
　　 3.將不同體積分

9、數(shù)的卵巢癌細胞上清液作用于EPC培養(yǎng)基中，觀察不同濃度的HPA對EPC體外管樣結構形成、增值及遷移能力的影響。
　　 結果：
　　 1.早期培養(yǎng)單核細胞形態(tài)異質性較大，主要以小圓形為主，其間夾雜大而圓的紅細胞。分離的單核細胞接種于包被有人纖維粘連蛋白的培養(yǎng)瓶中，并使用專用培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)，靜置48h后，將未貼壁的懸浮細胞再次重新接種；3d后貼壁細胞開始伸展成梭形或紡錘形，5-7d后有細胞集落形成，呈梭樣鋪路石樣改變，大約2

10、1d后逐步融合成單層內皮細胞。流式細胞儀檢測顯示，培養(yǎng)第5-14d的EPC均穩(wěn)定均一的表達VEGFR-2(95.30%)、CD34(47.22%)，CD133(57.29%)，并采用雙熒光染色檢測，EPC具有吞噬Dil-acLDL和結合FITC-UEA-1的能力。
　　 2.構建HPA-shRNA慢病毒載體，轉染人卵巢癌skov3細胞。實驗中設計的3對干擾序列存在差異性，其中HPA-shRNA-1和HPA-shRNA-2序列的干

11、擾效果佳；HPA-shRNA-3序列則未達到干擾效果。采用Real-timePCR、Western blot分別檢測HPA在基因和蛋白水平方面的表達。結果：shRNA能特異性阻斷卵巢癌skov3細胞HPA的表達，并篩選出有效轉染的細胞穩(wěn)定傳代。
　　 3.不同體積分數(shù)卵巢癌細胞上清液作用于EPC培養(yǎng)基中，觀察其中不同濃度的HPA對EPC體外管樣結構形成、增殖、遷移的影響。證實了卵巢癌細胞分泌的HPA對EPC增值、遷移和管腔形成能

12、力有顯著促進作用。
　　 結論：
　　 1.EPC的成功體外分離，專用培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)，第5-14d獲得較穩(wěn)定的EPC。大約3w后融合成單層內皮細胞，失去祖細胞特性。
　　 2.構建HPA-shRNA慢病毒載體轉染人卵巢癌skov3細胞，有效降低了HPA的表達，獲得高效轉染。
　　 3.不同體積分數(shù)卵巢癌細胞上清液作用于EPC培養(yǎng)基中，其中所含的HPA的上清液對EPC體外管樣結構形成、增殖及遷移能力有直接的