HPA對(duì)臍血來源EPC體外管樣結(jié)構(gòu)形成、增值及遷移能力影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 卵巢癌發(fā)病率占婦科惡性腫瘤的46%，因其具有起病隱匿、易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)快、臨床治療效果差、5年生存率低等特點(diǎn)。目前，已經(jīng)嚴(yán)重威脅婦女生命和健康的[1-2]，其早期診斷和有效治療已成為臨床診療的瓶頸。隨著逐步對(duì)惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的認(rèn)識(shí)，現(xiàn)已證實(shí)卵巢癌中有著活躍的血管生成，并對(duì)其發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)歸等方面起著重要作用。從骨髓、臍血或外周血分離出來的內(nèi)皮組細(xì)胞(endothelial progenitor c

2、ell，EPC)能夠在趨化因子和生長因子等刺激下募集，歸巢于腫瘤血管新生位點(diǎn)，促進(jìn)微血管床芽生，參與腫瘤血管生成。越來越多的研究證實(shí)，EPC在腫瘤新生血管的形成中起著重要的作用，參與腫瘤血管的發(fā)生、發(fā)展，并促進(jìn)腫瘤的生長、侵潤和轉(zhuǎn)移。并發(fā)現(xiàn)由腫瘤分泌的諸如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等生長因子，不僅局部起作用，而且可以動(dòng)員從骨髓來源的EPC，定居于血管床。在對(duì)胰島素瘤

3、的研究中發(fā)現(xiàn)，骨髓來源EPC參與腫瘤新生血管床的生成[3]。在研究膠質(zhì)瘤中也證實(shí)了腫瘤細(xì)胞大量分泌VEGF，促進(jìn)EPC定居于瘤床，并促進(jìn)其分化參與管道形成的同時(shí)，也對(duì)腫瘤細(xì)胞的自我更新、分化產(chǎn)生一定的影響[4]。在早期肝癌中，骨髓來源的EPC占腫瘤新生血管內(nèi)皮的6%，而在晚期肝癌中可達(dá)27%，并證實(shí)在腫瘤血管生成過程中，存在EPC的參與[5]。
　　 乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是參與降解惡性腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜

4、的關(guān)鍵功能酶之一，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。隨著國內(nèi)外研究的進(jìn)展，人們對(duì)HPA認(rèn)識(shí)的深入，發(fā)現(xiàn)HPA在卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于卵巢正常組織，并隨腫瘤惡性程度及分期的升高其表達(dá)水平呈增高趨勢；并證實(shí)卵巢癌組織中HPA的表達(dá)隨著VEGF表達(dá)的增強(qiáng)則增高，提示HPA通過釋放、激活VEGF來促進(jìn)腫瘤血管生成。故推測，在惡性腫瘤中，腫瘤細(xì)胞與EPC之間構(gòu)成的微環(huán)境可能存在著相互作用，這種作用可能是雙向的：微環(huán)境中血管性細(xì)胞支持癌細(xì)胞的

5、分化和更新，而癌細(xì)胞同時(shí)具有維持微環(huán)境細(xì)胞的作用。因此在卵巢癌中可能同樣存在這種微環(huán)境-niches，當(dāng)有腫瘤細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子，與EPC之間產(chǎn)生相互作用，以促進(jìn)腫瘤血管生成。鑒于我們?cè)谇捌谠囼?yàn)中已經(jīng)證實(shí)人卵巢癌組織中HPA的表達(dá)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、臨床分期和微血管密度等有關(guān)[6]；且HPA在人卵巢癌skov3細(xì)胞中的高表達(dá)[7]。此次實(shí)驗(yàn)研究針對(duì)EPC與卵巢癌細(xì)胞之間可能存在一種微環(huán)境，卵巢癌細(xì)胞分泌的HPA能否促進(jìn)EPC體外管腔形成

6、這一現(xiàn)象進(jìn)行研究，并進(jìn)一步研究其對(duì)EPC增值、遷移能力的影響。
　　 基于既往研究結(jié)果，提出卵巢癌中存在“腫瘤細(xì)胞和EPC共處壁龕(tumor cell-endothelial progenitor cell niches，T-E niches)”的假說，推測腫瘤細(xì)胞分泌細(xì)胞因子或酶與EPC之間相互作用，促進(jìn)腫瘤血管生成，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的演進(jìn)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
　　 目的：
　　 闡明卵巢癌skov3細(xì)胞分泌的HPA

7、對(duì)臍血來源的EPC體外管養(yǎng)結(jié)構(gòu)形成及其增值、遷移能力的影響，探討卵巢癌細(xì)胞與EPC之間相互作用的具體機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.采用密度梯度離心法分離臍血來源的單核細(xì)胞，使用含10%或20%FBS的EGM-2培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)至第5-14d，獲得較均一、貼壁狀態(tài)好、生長旺盛的EPC。采用激光共聚焦檢測其吞噬Dil-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-1的能力(雙熒光染色檢測)；并采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測其細(xì)胞表面表達(dá)CD34、

8、CD133、VEGFR-2，以此共同鑒定臍血來源的EPC。
　　 2.構(gòu)建HPA-ShRNA慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人卵巢癌skov3細(xì)胞，抑制其HPA的表達(dá)；并采用real-time PCR、Western blot分別檢測卵巢癌細(xì)胞分泌HPA的基因和蛋白表達(dá)水平，驗(yàn)證阻斷效應(yīng)。并篩選出沉默效果最佳干擾序列的細(xì)胞穩(wěn)定傳代后，收集阻斷分泌HPA前、后的細(xì)胞上清液，采用ELISA檢測其中分泌的HPA表達(dá)水平。
　　 3.將不同體積分

9、數(shù)的卵巢癌細(xì)胞上清液作用于EPC培養(yǎng)基中，觀察不同濃度的HPA對(duì)EPC體外管樣結(jié)構(gòu)形成、增值及遷移能力的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.早期培養(yǎng)單核細(xì)胞形態(tài)異質(zhì)性較大，主要以小圓形為主，其間夾雜大而圓的紅細(xì)胞。分離的單核細(xì)胞接種于包被有人纖維粘連蛋白的培養(yǎng)瓶中，并使用專用培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，靜置48h后，將未貼壁的懸浮細(xì)胞再次重新接種；3d后貼壁細(xì)胞開始伸展成梭形或紡錘形，5-7d后有細(xì)胞集落形成，呈梭樣鋪路石樣改變，大約2

10、1d后逐步融合成單層內(nèi)皮細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測顯示，培養(yǎng)第5-14d的EPC均穩(wěn)定均一的表達(dá)VEGFR-2(95.30%)、CD34(47.22%)，CD133(57.29%)，并采用雙熒光染色檢測，EPC具有吞噬Dil-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-1的能力。
　　 2.構(gòu)建HPA-shRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人卵巢癌skov3細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的3對(duì)干擾序列存在差異性，其中HPA-shRNA-1和HPA-shRNA-2序列的干

11、擾效果佳；HPA-shRNA-3序列則未達(dá)到干擾效果。采用Real-timePCR、Western blot分別檢測HPA在基因和蛋白水平方面的表達(dá)。結(jié)果：shRNA能特異性阻斷卵巢癌skov3細(xì)胞HPA的表達(dá)，并篩選出有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞穩(wěn)定傳代。
　　 3.不同體積分?jǐn)?shù)卵巢癌細(xì)胞上清液作用于EPC培養(yǎng)基中，觀察其中不同濃度的HPA對(duì)EPC體外管樣結(jié)構(gòu)形成、增殖、遷移的影響。證實(shí)了卵巢癌細(xì)胞分泌的HPA對(duì)EPC增值、遷移和管腔形成能

12、力有顯著促進(jìn)作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.EPC的成功體外分離，專用培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，第5-14d獲得較穩(wěn)定的EPC。大約3w后融合成單層內(nèi)皮細(xì)胞，失去祖細(xì)胞特性。
　　 2.構(gòu)建HPA-shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染人卵巢癌skov3細(xì)胞，有效降低了HPA的表達(dá)，獲得高效轉(zhuǎn)染。
　　 3.不同體積分?jǐn)?shù)卵巢癌細(xì)胞上清液作用于EPC培養(yǎng)基中，其中所含的HPA的上清液對(duì)EPC體外管樣結(jié)構(gòu)形成、增殖及遷移能力有直接的