小劑量CpG DNA預(yù)處理對(duì)細(xì)菌膿毒癥小鼠保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的膿毒癥是嚴(yán)重?zé)齻?、?chuàng)傷的常見并發(fā)癥，其病死率較高，因此研究膿毒癥的發(fā)病機(jī)制及防治措施具有重要意義。未甲基化的CpG寡核苷酸片段(CpGoligonucleotides，CpGODN)是細(xì)菌DNA的免疫刺激作用的最小作用單位，是強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)劑。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CpGDNA可以增強(qiáng)小鼠和雞抵抗多種細(xì)菌導(dǎo)致的膿毒癥，作用機(jī)制可能與其抑制單核/巨噬細(xì)胞釋放致炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6等有關(guān)。為此，本研究旨在明確小劑量CpGDNA預(yù)

2、處理對(duì)細(xì)菌膿毒癥模型小鼠的保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，研究CpGDNA預(yù)處理拮抗細(xì)菌膿毒癥的作用機(jī)制，為CpGDNA的可能臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法①RAW264.7細(xì)胞經(jīng)生理鹽水(NS)、CpGDNA預(yù)處理后，再給予大劑量CpGDNA刺激細(xì)胞，觀察小劑量CpGDNA預(yù)處理對(duì)大劑量CpGDNA刺激細(xì)胞釋放TNF-α的抑制作用，并明確其量效、時(shí)效關(guān)系；②采用尾靜脈注射LD90熱滅活大腸桿菌，建立細(xì)菌膿毒癥小鼠模型，觀察小劑量CpGDNA預(yù)

3、處理的保護(hù)作用；③采用流式細(xì)胞術(shù)觀察小劑量CpGDNA預(yù)處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞表面DNA結(jié)合能力及DNA內(nèi)化的影響；④采用免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦術(shù)觀察小劑量CpGDNA預(yù)處理對(duì)胞膜TLR9及胞內(nèi)TLR9表達(dá)的影響；⑤采用電泳遷移率改變分析(EMSA)方法觀察CpGDNA預(yù)處理對(duì)細(xì)胞NF-κB活化的抑制作用。 結(jié)果①4μg/mlCpGDNA預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞24h能顯著抑制大劑量CpGDNA(20μg/m

4、l)誘導(dǎo)的TNF-α釋放，并呈明顯的量效和時(shí)效關(guān)系；②2.5mg/kgCpGDNA預(yù)處理3天能顯著降低熱滅活大腸桿菌攻擊小鼠的死亡率，死亡率由90％降低至40％；③小劑量CpGDNA預(yù)處理顯著抑制細(xì)胞表面DNA結(jié)合，減少DNA內(nèi)化；④小劑量CpGDNA預(yù)處理能顯著抑制胞內(nèi)TLR9的表達(dá)，卻增強(qiáng)胞膜TLR9的表達(dá)；⑤小劑量CpGDNA預(yù)處理抑制大劑量CpGDNA誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化。 結(jié)論小劑量CpGDNA預(yù)處理對(duì)細(xì)菌