PA-MSHA預(yù)處理對(duì)膿毒癥-嚴(yán)重膿毒癥大鼠腸道損傷的預(yù)防作用研究.pdf

1、目的:
　　本課題通過腹腔內(nèi)注射混合活菌株建立膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥大鼠模型，研究銅綠假單胞菌菌毛甘露糖敏感血凝素（PA-MSHA）預(yù)處理對(duì)膿毒癥及嚴(yán)重膿毒癥大鼠腸組織和腹腔灌洗液細(xì)胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α、IL-10）的影響；對(duì)腸道ICAM-1、VCAM-1表達(dá)的影響；對(duì)外周血中性粒細(xì)胞表面TLR4表達(dá)的影響；對(duì)外周血中性粒細(xì)胞體外趨化的影響。旨在探討PA-MSHA對(duì)膿毒癥/嚴(yán)重膿毒癥大鼠腸道損傷的可能預(yù)防機(jī)制。

2、>　　方法:
　　（1）選取健康清潔SPF級(jí)雄性SD大鼠40只（230±10g），將大鼠隨機(jī)分為5組：空白組、膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組、PA-嚴(yán)重膿毒癥組。
　?。?）預(yù)給藥：連續(xù)給藥7天，空白組、膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組分別給予0.9％氯化鈉注射液（0.3ml/只/天背部皮下注射）；PA-膿毒癥組、PA-嚴(yán)重膿毒癥組分別給予（PA-MSHA0.3ml/只/天背部皮下注射）。
　?。?）第8天造模，空白組取

3、3ml0.9%氯化鈉注射液經(jīng)大鼠右下腹腹腔注射；膿毒癥組、PA-膿毒癥組取1.6ml/kg糞便懸液（根據(jù)Gonnert FA人糞便懸液腹腔注射法改良預(yù)先制備好），0.9%氯化鈉注射液稀釋至3 mL，經(jīng)大鼠右下腹腹腔注射；嚴(yán)重膿毒癥組、PA-嚴(yán)重膿毒癥組取4ml/kg糞便懸液，0.9%氯化鈉注射液稀釋至3mL，經(jīng)大鼠右下腹腹腔注射。
　　（4）模型建立成功后，用3%戊巴比妥鈉注射液麻醉大鼠，監(jiān)測(cè)大鼠平均動(dòng)脈壓。I、腹腔灌洗并回收腹腔

4、灌洗液（回收率≥80%），ELISA法測(cè)定細(xì)胞因子IL-1、IL-6、TNF-α、IL-10的濃度。II、腹主動(dòng)脈取血行血培養(yǎng)、分離中性粒細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)中性粒細(xì)胞表面TLR4表達(dá)；Transwell小室法測(cè)中性粒細(xì)胞體外趨化個(gè)數(shù)。III、動(dòng)物處死后，留取遠(yuǎn)端空腸組織約2cm行HE染色，光鏡下觀察組織病理形態(tài)變化。IV、另留取距離十二指腸球部遠(yuǎn)端10cm處空腸組織約2cm，勻漿后通過ELISA測(cè)細(xì)胞因子（IL-1、IL-6、TNF

5、-α、IL-10）和粘附分子（ICAM-1、VCAM-1）的濃度。
　　結(jié)果：
　　（1）平均動(dòng)脈壓及血培養(yǎng)：與空白組比較，膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組、PA-嚴(yán)重膿毒癥組4組平均動(dòng)脈壓明顯降低?？瞻捉M血培養(yǎng)無細(xì)菌生長(zhǎng)；其余4組血培養(yǎng)結(jié)果均為大腸埃希菌（+）。
　　（2）病理學(xué)改變：解剖后，空白組腸管呈粉紅色，血供良好；其余4組均有不同程度腸壁色澤變暗、充血、水腫、積氣或粘連。石蠟切片HE染色：空白組腸上皮細(xì)

6、胞完整，上皮和固有層連接緊密無縫隙，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腸腺體正常；其余4組均有不同程度的上皮細(xì)胞破壞、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、固有層水腫和毛細(xì)血管擴(kuò)張。
　　（3）腹腔灌洗液細(xì)胞因子濃度：
　?、俅傺滓蜃樱↖L-1、IL-6、TNF-α）濃度：與空白組比較，膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組、PA-嚴(yán)重膿毒癥組促炎因子濃度均升高（P＜0.05）；其中嚴(yán)重膿毒癥組高于膿毒癥組（P＜0.05）；膿毒癥組高于PA-膿毒癥組（P＜0.05）；

7、嚴(yán)重膿毒癥組高于PA-嚴(yán)重膿毒癥組（P＜0.05）。
　　②抑炎因子（IL-10）濃度：與空白組比較，膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組、PA-嚴(yán)重膿毒癥組均升高（P＜0.05）；進(jìn)一步比較，膿毒癥組IL-10濃度高于PA-膿毒癥組（P＜0.05）；嚴(yán)重膿毒癥組高于PA-嚴(yán)重膿毒癥組（P＜0.05）。
　　（4）腸組織細(xì)胞因子和粘附分子濃度：
　?、俅傺滓蜃樱↖L-1、IL-6、TNF-α）濃度：與正常組比較，膿毒

8、癥組、PA-膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組、PA-嚴(yán)重膿毒癥組促炎因子濃度均升高（P＜0.05）；其中嚴(yán)重膿毒癥組高于膿毒癥組（P＜0.05）；膿毒癥組高于PA-膿毒癥組（P＜0.05）；嚴(yán)重膿毒癥組高于PA-嚴(yán)重膿毒癥組（P＜0.05）。
　?、谝盅滓蜃樱↖L-10）濃度：與正常組比較，膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組、PA-嚴(yán)重膿毒癥組均升高（P＜0.05）；膿毒癥組IL-10濃度低于PA-膿毒癥組（P＜0.05）；嚴(yán)重膿毒癥組

9、低于PA-嚴(yán)重膿毒癥組（P＜0.05）。
　?、奂?xì)胞粘附分子（ICAM-1、VCAM-1）濃度：與空白組相比，膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組、PA-嚴(yán)重膿毒癥組腸道ICAM-1、VCAM-1濃度均升高（P＜0.05）；其中膿毒癥組ICAM-1、VCAM-1表達(dá)濃度高于PA-膿毒癥組（P＜0.05）；但嚴(yán)重膿毒癥組VCAM-1表達(dá)水平與PA-嚴(yán)重膿毒癥組相比無明顯變化（P=0.262）。
　?。?）流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血

10、中性粒細(xì)胞表面TLR4表達(dá)：與空白組比較，膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組、PA-嚴(yán)重膿毒癥組TLR4表達(dá)均升高（P＜0.05）；膿毒癥組TLR4表達(dá)低于嚴(yán)重膿毒癥組；膿毒癥組高于PA-膿毒癥組（P＜0.05）；嚴(yán)重膿毒癥組高于PA-嚴(yán)重膿毒癥組（P＜0.05）。
　?。?）Transwell小室法測(cè)中性粒細(xì)胞體外趨化個(gè)數(shù)：與空白組比較，膿毒癥組、PA-膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組、PA-嚴(yán)重膿毒癥組中性粒細(xì)胞體外趨化個(gè)數(shù)均減少（

11、P＜0.05）；嚴(yán)重膿毒癥組趨化個(gè)數(shù)少于膿毒癥組（P＜0.05）；膿毒癥組個(gè)數(shù)少于PA-膿毒癥組（P＜0.05）；嚴(yán)重膿毒癥組個(gè)數(shù)少于PA-嚴(yán)重膿毒癥組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、腹腔感染引起的膿毒癥/嚴(yán)重膿毒癥可導(dǎo)致大鼠腹腔、腸道局部細(xì)胞因子水平升高；PA-MSHA預(yù)處理可通過降低局部細(xì)胞因子濃度，減輕膿毒癥大鼠腸道炎癥損害，預(yù)防膿毒癥。
　　2、腹腔感染引起的膿毒癥/嚴(yán)重膿毒癥均可使大鼠腸道ICAM-1

12、、VCAM-1表達(dá)水平升高；PA-MSHA預(yù)給藥能通過抑制膿毒癥大鼠腸道ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)水平，從而在一定程度上減輕、中度膿毒癥大鼠腸道炎癥反應(yīng)。
　　3、PA-MSHA預(yù)給藥能抑制中性粒細(xì)胞表面TLR4及其下游信號(hào)通路的表達(dá)，改善中性粒細(xì)胞免疫麻痹，增加中性粒細(xì)胞體外移行個(gè)數(shù)，從而降低全身炎癥水平，減少組織損傷。
　　4、PA-MSHA預(yù)給藥能通過減輕全身和局部（腹腔、腸道）炎癥反應(yīng)，從而對(duì)膿毒癥引起的腸道損