胰腺癌等腫瘤標(biāo)志物(CA19-9)單克隆抗體制備及檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、糖類(lèi)抗原19-9(carbohydrateantigen19-9，CA19-9)是一類(lèi)組成型表達(dá)糖蛋白，在正常人和胰腺癌、胃癌等癌癥患者血清中均能表達(dá)，但在正常人血清中的表達(dá)量普遍較低。目前CA19-9已是應(yīng)用于臨床的一類(lèi)腫瘤標(biāo)志物，它與多種癌癥均具有相關(guān)性，其中尤其與胰腺癌相關(guān)性較高，可達(dá)到約70％，因此，CA19-9可以作為癌癥相關(guān)性檢測(cè)指標(biāo)。糖類(lèi)抗原因免疫原性較弱，常規(guī)免疫效果所需免疫劑量與免疫周期均較高，因此增加了單克隆抗體制備

2、周期。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)比新型佐劑與傳統(tǒng)佐劑免疫的效果，結(jié)合半固體培養(yǎng)基（甲基纖維素MC）克隆化法制備單克隆抗體，從而縮短單克隆抗體制備周期。利用上述方法制備獲得的CA19-9單克隆抗體構(gòu)建雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，與國(guó)外同類(lèi)試劑盒進(jìn)行性能對(duì)比，評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法優(yōu)劣，探討其是否可應(yīng)用于臨床檢測(cè)及將來(lái)的規(guī)?；a(chǎn)。
　　免疫佐劑因可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫反應(yīng)而被廣泛使用，本實(shí)驗(yàn)選用QuickAntibody新型免疫佐劑與弗氏完全佐劑、

3、弗式不完全佐劑分別對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，二者采取不同的免疫方式、免疫周期與免疫劑量，依據(jù)血清效價(jià)檢測(cè)值評(píng)價(jià)免疫效果和待融合小鼠。細(xì)胞融合后利用半固體培養(yǎng)基（甲基纖維素）克隆化法進(jìn)行克隆化。獲得的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株制備腹水后利用辛酸硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化。經(jīng)單克隆抗體鑒定后，將合格的單克隆抗體進(jìn)行配對(duì)，并進(jìn)行檢測(cè)體系探索，最終確立CA19-9雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。
　　免疫效價(jià)結(jié)果表明:QucikAntibody免疫方式可

4、在3周達(dá)到常規(guī)弗氏完全佐劑的免疫效果。3次細(xì)胞融合的融合率分別為:88.3％、83.9％和91.2％，半固體克隆化(MC)法最終篩得單克隆抗體3株，分別為:ZJY1-2C8、ZJY2-7F10、ZJY3-1G9。利用ZJY3-1G9作為包被抗體，ZJY2-7F10作為酶標(biāo)抗體的配對(duì)結(jié)果，構(gòu)建雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。室內(nèi)參照品依據(jù)國(guó)外試劑盒確定，最終得到的線性方程為:y=0.0063x+0.0967，R2=0.9895。線性范圍為3

5、0U/mL～300U/mL。批內(nèi)與批間精密性變異系數(shù)CV值均小于10％，符合要求。穩(wěn)定性:37℃、2℃-8℃分別放置6天后檢測(cè)樣本OD值與未放置前基本相同，線性關(guān)系良好。依照構(gòu)建的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法與國(guó)外試劑盒對(duì)比檢測(cè)33份病患血清，二者相關(guān)性良好，r=0.9504，回歸方程:y=0.9111x+2.076。
　　本實(shí)驗(yàn)最終得到3株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，獲得一對(duì)配對(duì)單克隆抗體，初步建立了CA19-9雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法