PP2A調(diào)控大斑剛毛座腔菌生長發(fā)育的機制及其與TOR途徑的關(guān)系研究.pdf

1、TOR是雷帕霉素的作用靶標，在絲狀真菌中，TOR通過激活蛋白激酶的活性以及抑制蛋白磷酸酯酶的活性，使一些下游的效應(yīng)物磷酸化，進而達到對細胞生長所需要的一些營養(yǎng)物質(zhì)代謝的調(diào)控，最終實現(xiàn)對細胞生長的調(diào)控作用。PP2A參與調(diào)節(jié)細胞周期、細胞代謝、信號轉(zhuǎn)導等多種生物學過程，PP2A通過終止參與各種磷酸化的過程來阻止細胞進入有絲分裂時期。對PP2A的調(diào)控是TOR信號轉(zhuǎn)導的另一個重要機制。TOR的許多下游效應(yīng)物，在經(jīng)過雷帕霉素處理后，會迅速發(fā)生去磷

2、酸化作用，這些去磷酸化的過程就依靠PP2A和SIT4來完成。大斑剛毛座腔菌（Setosphaeia turcica，俗稱玉米大斑病菌）是引起玉米大斑病的致病菌，嚴重威脅玉米生產(chǎn)安全。本研究利用前期已經(jīng)獲得的StPP2A-C缺失突變體，對其附著胞膨壓、糖原、甘油含量等方面進行了系統(tǒng)分析，并通過qRT-PCR方法對其轉(zhuǎn)錄組的部分差異基因進行了驗證，對PP2A調(diào)控病菌生長發(fā)育的機制進行了深入探索;利用雷帕霉素對大斑病菌野生型(WT)與PP2A

3、-C缺失突變體(H5)處理后，通過菌株的菌落形態(tài)、菌絲生長以及形態(tài)、分生孢子產(chǎn)量、附著胞形成以及穿透、TOR通路關(guān)鍵基因與PP2A基因表達量的測定，細胞自噬的觀察以及細胞自噬基因表達量的測定等來明確雷帕霉素對大斑病菌的影響，并明確PP2A與TOR通路的關(guān)系以及PP2A與細胞自噬的關(guān)系。同時，還對PP2A-C基因進行了原核表達，并將其蛋白純化，為調(diào)取互作蛋白作準備。并且對PP2A-C缺失突變體做了進一步分析，主要結(jié)果如下:
　　1.

4、對不同碳氮源的察氏培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基上WT與H5的生長情況進行了比較，發(fā)現(xiàn)H5在PDA上生長明顯比WT慢，而在察氏培養(yǎng)基上H5與WT生長速率幾乎相同，甚至比野生型快。
　　2。對WT以及H5附著胞分析顯示，H5的膨壓比WT中低，在4.5MPa左右，而WT的膨壓則在5.4MPa左右。但是，H5的甘油含量比WT中多，H5的甘油含量為62.5μmol/mL，WT的甘油含量為25.5μmol/mL。通過糖原染色觀察發(fā)現(xiàn)WT的糖原含量比H

5、5中高。
　　3。對轉(zhuǎn)錄組中WT與H5的差異基因進行了初步分析，共找到了286個差異基因，其中165個上調(diào)，121個下調(diào)，并且通過qRT-PCR方法對部分差異基因與效應(yīng)因子進行了驗證，發(fā)現(xiàn)結(jié)果正確。并且發(fā)現(xiàn)了兩條與糖代謝有關(guān)的代謝通路。
　　4.雷帕霉素處理大斑病菌，能夠抑制病菌菌落生長，隨著雷帕霉素濃度的升高，對菌株的抑制效果越明顯。并且產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)、附著胞產(chǎn)生以及附著胞穿透情況都受到明顯抑制，PP2A-C的缺失使菌株

6、對雷帕霉素更為敏感，所以受到的抑制作用更強。
　　5.雷帕霉素處理后，菌絲體會產(chǎn)生細胞自噬現(xiàn)象。正常情況下，WT的自噬現(xiàn)象比H5中稍微明顯，但是在雷帕霉素處理后，H5中的細胞自噬現(xiàn)象卻比WT中更為明顯。
　　6.構(gòu)建了StPP2A-C與StTAP42的酵母雙雜交載體，并用酵母雙雜交驗證了StPP2A-C與stTAP42的互作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它們確實存在互作。
　　7.構(gòu)建了StPP2A-C原核表達載體，并且對StPP2A-C

7、進行了原核表達，獲得較純的StPP2A-C蛋白，為后續(xù)調(diào)取PP2A-C的互作蛋白提供了依據(jù)。
　　8.構(gòu)建了StPP2A-B的敲除載體并初步獲得兩株轉(zhuǎn)化子，為后續(xù)繼續(xù)研究PP2A功能提供了基礎(chǔ)。同時本研究還構(gòu)建了StPP2A-B基因的RNAi沉默載體。
　　綜上所述，PP2A可以通過影響病菌菌絲的生長、影響附著胞膨壓的降低、附著胞內(nèi)甘油含量從而影響大斑病菌的生長發(fā)育。雷帕霉素處理能夠影響病菌的生長發(fā)育，尤其是PP2A-C敲除