生長抑素作為全身炎癥反應(yīng)放大的內(nèi)源性保護(hù)因素研究——從中性粒細(xì)胞到補(bǔ)體激活.pdf

1、背景和目的 多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)是創(chuàng)傷及感染后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，對其進(jìn)行臨床研究具有重要的意義。PMN凋亡異常引起功能及數(shù)量上的改變，是MODS發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。中性粒細(xì)胞作為炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞，一方面對機(jī)體的防御起著重要作用，另一方面在炎癥部位長期存活則可加重組織損傷。補(bǔ)體系統(tǒng)(complement system)是機(jī)體抵御病原體入侵的主要

2、效應(yīng)系統(tǒng)，是天然免疫系統(tǒng)的一個重要組成部分。補(bǔ)體在MODS的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。缺血再灌注腸道促炎介質(zhì)放大炎癥反應(yīng)，引起MODS，腸道麻痹、梗阻、功能障礙使腸道成為病原庫和毒素庫，導(dǎo)致MODS，后期繼發(fā)感染進(jìn)一步加重腸功能障礙，因此腸道是MODs的啟動器官和靶器官。生長抑素(somatostatin，SST)對免疫系統(tǒng)的影響已逐漸被認(rèn)識。探討多器官功能障礙綜合征的規(guī)律，以增加對全身炎癥反應(yīng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的認(rèn)識，為臨床治療各種

3、原因?qū)е碌腗ODS提供新思路。 方法 給健康獼猴獼猴皮下注射麻醉劑麻醉動物，常規(guī)外科消毒鋪巾，取腹正中切口，逐層分離入腹腔后，分離腸系膜上動脈后予以夾閉，60 min后松夾進(jìn)行再灌注，恢復(fù)腸系膜上動脈血流。在距回盲部5cm處切除回腸2cm，用以測定組織中SST。IIR前后外周靜脈采血lOml，用于測定SST。用放射免疫分析法測定外周血、腸黏膜生長抑素濃度。采集健康獼猴HR前和IIR后2、6、24 h外周靜脈血，肝素抗凝

4、。Pcrcoll不連續(xù)密度梯度離心法分離純化PMN。腹腔巨噬細(xì)胞分離收集，健康獼猴，于RR前、IIR后24 h，灌洗腹腔，回收灌洗液。在獼猴IIR后，觀察血中性粒細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞凋亡情況。SST與獼猴外周血PMN、腹腔巨噬細(xì)胞體外共同孵育后，觀察PMN、腹腔巨噬細(xì)胞的形態(tài)變化，采用顯微鏡、熒光顯微鏡觀察獼猴外周血中性粒細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞的形態(tài)變化。流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。DNA抽提及DNA電泳，紫外光透射儀下觀察電泳條帶并拍照，電泳

5、分析細(xì)胞DNA斷裂片段，觀察DNA電泳凋亡帶(DNA Ladder)。透射電鏡下觀察獼猴外周血中性粒細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞的形態(tài)變化并攝片。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Bcl-2、IL-1、NF-κB。用生物分子相互作用系統(tǒng)(Biacore)檢測PMN上生長抑素受體(SSTR-1、SSTR-2)。免疫速率散射比濁法進(jìn)行檢測補(bǔ)體、CRP，采用IMMGE免疫速率散射比濁儀(Beckman Coulter，加利福尼亞，美國)及配套試劑進(jìn)行檢測。CHso法測

6、定總補(bǔ)體，將新鮮待檢血清做不同稀釋后，與致敏的綿羊紅細(xì)胞反應(yīng)，以50％溶血時的最小血清量判定終點，測定補(bǔ)體總?cè)苎钚浴Ｓ蒙L抑素與獼猴血清作用，測定補(bǔ)體、CRP。肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，用生長抑素與分離的肝細(xì)胞培養(yǎng)，測定補(bǔ)體、CRP。采用聚乙二醇(PGE艦淀法測定循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC)，應(yīng)用IMMGE(Beckman Coulter，加利福尼亞，美國)中的紫外分光檢測部分進(jìn)行檢測。腸缺血再灌注后24h，手術(shù)取出動物的小腸、心、肝、腎、肺、

7、腦等器官進(jìn)行組織學(xué)觀察。 結(jié)果 1.獼猴重要器官的改變，IIR后24h，所有獼猴均出現(xiàn)了MODS，腸、肺、肝、腎等重要器官組織學(xué)觀察，均發(fā)現(xiàn)有明顯的炎性損傷。2.獼猴ⅡR后，獼猴外周血及小腸黏膜中SST含量均明顯下降；小腸黏膜SST含量在ⅡR前、后分別為256.4l±7.98ng/mg組織和179.83±44.5ng/mg組織，外周血SST含量則分別為160.6l±33.84ng/mg和62.7±13.56png/mg

8、，p<0.01。3.PMN凋亡率由ⅡR前的15.4±1.4[％]，顯著降低至ⅡR后24 h 3.5±0.5[％]；4.腹腔巨噬細(xì)胞凋亡率由腸缺血再灌注前14.1±1.6[％]增加至腸缺血再灌注后24 h 20.2±1.8[％]；5 .外實驗表明，SKT 可使獼猴外周血中性粒細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)特征性改變，顯微鏡觀察見中性粒細(xì)胞體積變小，胞漿濃縮，胞核固縮，染色質(zhì)凝集邊聚，核碎裂。丫啶橙、溴化乙錠混合熒光染色，凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小，胞

9、漿濃縮，核內(nèi)染色質(zhì)固縮成團(tuán)，染色質(zhì)凝集，細(xì)胞呈桔紅色，對照組細(xì)胞細(xì)胞體積較大，核膜、胞膜完整，呈綠色，核結(jié)構(gòu)正常。6.PMN超微結(jié)構(gòu)變化：透射電鏡觀察到，SST作用后的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核電子密度加大，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞膜皺縮出現(xiàn)皺摺、卷曲，形成膜表面的芽狀突起。細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器密度增高，細(xì)胞器密集壓縮，核染色質(zhì)固縮致密，聚集于核膜下成塊狀，為染色質(zhì)邊聚，細(xì)胞核固縮變小。未經(jīng)SST作用對照組PMN體積較大，核膜、胞膜完整，細(xì)胞質(zhì)染色

10、淡，細(xì)胞器排列疏松，細(xì)胞核較大。7.PMN的DNA片段斷裂分析電泳可見Ladder帶。8.體外SST對PMN凋亡的影響，PMN凋亡率明顯高于對照組；生長抑素能抑制巨噬細(xì)胞凋亡，巨噬細(xì)胞凋亡比例降低。9.PMN上SSTR能與SSTR-1抗體、SSTR-2抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，其特異結(jié)合量分別為548±20RU/ml及28±21RU/ml。10.MODS時血清補(bǔ)體C<,3>活性降低，血清補(bǔ)體C<,3> ⅡR前為0.9992±0.14g／1，II

11、R后24h為0.7024±0.18 g／l；MODS時血清總補(bǔ)體活性降低，總補(bǔ)體IIR前為106.6±18.07U／ml，IIR后為62.1±9.52U／m。11.MODS時血清補(bǔ)體C<,4>活性沒有改變，血清補(bǔ)體C<,4>IIR前為O.1342±0.07g／l，IIR后24h為O.1420±0.06 g／l。12.MODS時血清CRP升高，IIR前為4.33±1.31mg／lIIR后為17.73±0．86 mg／l；MODS時血清循環(huán)

12、免疫復(fù)合物測定，IIR后血清循環(huán)免疫復(fù)合物無明顯變化，IIR前為0.013±0.005 O.D，IIR后為0.030±0.01 O.D，無統(tǒng)計學(xué)意義。13.生長抑素對血清補(bǔ)體影響，在IIR前、IIR后2、6、24h各時段，IIR+SST組與IIR組比較，血清補(bǔ)體C<,3>阻斷后24 h IIR+SST組為0.7084±0.19g／1，IIR組為0.7024±O.18g／1；血清補(bǔ)體C<,4>阻斷后24 h IIR+SST組為O.1293

13、±0.04g／1，IIR組為O.1420±0.06g／1；血清總補(bǔ)體阻斷后24總補(bǔ)體SST組與IIR組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義。不同濃度生長抑素對血清補(bǔ)體沒有明顯作用，隨著生長抑素濃度增加，血清補(bǔ)體沒有明顯改變，與生長抑素及其濃度無關(guān)。14.生長抑素對獼猴血清CRP、循環(huán)免疫復(fù)合物影響，在IIR前、IIR后24h各時段，IIR+SST組與IIR組與比較。血清CRP IIR后24h IIR+SST組為20.83±4.98g/l，IIR組為17.

14、73±0.86g/l；血清循環(huán)免疫復(fù)合物IIR后24 h IIR+SST組為0.0233±0.005 O.D，IIR組為0.0300±0.01 O.D，血清CRP、循環(huán)免疫復(fù)合物SST組與IIR組與比較無統(tǒng)計學(xué)意義。15.IL-1、NF-кB在IIR后，IL-1、NF-кB表達(dá)明顯增加，陽性細(xì)胞呈棕黃色，染色深。16.用Bcl-2免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察到，腸缺血再灌注后，PMN內(nèi)褐黃色。 結(jié)論 l.SST通過PMN上的相

15、應(yīng)受體誘導(dǎo)PMN凋亡，維持恰當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)；腸缺血-再灌注降低了小腸黏膜或外周血SST水平，使這一內(nèi)源性的生理保護(hù)機(jī)制受到破壞，其結(jié)果是，體內(nèi)促進(jìn)PMN凋亡的因素減少，PMN的壽命延長、壞死增加，由此加重腸黏膜等器官的組織損傷，炎癥失控，引起MODS。2.從多方面的形態(tài)學(xué)觀察、凋亡細(xì)胞定量及具有特征性的DNALadder凋亡帶的結(jié)果表明，SST能誘導(dǎo)PMN凋亡。3.巨噬細(xì)胞在體外與SST孵育后，不論是來自形態(tài)學(xué)還是流式細(xì)胞儀的檢測都表明，

16、SST可抑制巨噬細(xì)胞凋亡，這將有利于巨噬細(xì)胞吞噬凋亡PMN。如果凋亡的PMN細(xì)胞數(shù)量過多或凋亡的PMN由于種種原因不能及時被清除，單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞成熟度不夠，不能及時消化凋亡PMN，巨噬細(xì)胞對凋亡PMN的識別發(fā)生障礙等，將發(fā)生PMN壞死。4.通過生物分子交互作用分析系統(tǒng)測定PMN有SSTRl、SSTR2表達(dá)，SSTR是SST直接作用于PMN的主要途徑，是SST直接作用的分子靶點，說明SST的作用是通過SSTR實現(xiàn)的，本課題組采用先

17、進(jìn)的方法對SST的作用及作用機(jī)制進(jìn)行了研究，過去從未有該方面的研究報道，是本課題組的創(chuàng)新。5.MODS時獼猴血中性粒細(xì)胞凋亡抑制，中性粒細(xì)胞凋亡抑制在MODS發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。MODS時獼猴腹腔巨噬細(xì)胞凋亡增加，巨噬細(xì)胞凋亡增加在MODS發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。6.腸缺血再灌注后，PMN Bcl-2顆粒表達(dá)明顯增加，Bcl-2為凋亡抑制基因。7.腸缺血再灌注后，體內(nèi)補(bǔ)體通過旁路途徑激活消耗，陽性Bcl-2顆粒表達(dá)明顯增加。IL-l

18、、NF-KB活性異常升高，導(dǎo)致大量促炎細(xì)胞因子的過度釋放，形成一個正反饋活化環(huán)致使炎癥反應(yīng)持續(xù)并擴(kuò)大，發(fā)揮放大機(jī)制,由此加重器官的組織損傷，炎癥失控，是MODS發(fā)生、發(fā)展的重要原因，最終導(dǎo)致MODS，研究中的獼猴因此無一例外地發(fā)生了MODS。8.SST組與ILR組比較，兩組補(bǔ)體、CRP沒有明顯的改變，體外實驗生長抑素不能抑制補(bǔ)體活性，生長抑素不能影響肝細(xì)胞對補(bǔ)體、CRP的合成。但腸缺血再灌注后24h，SST組與ILR組比較，獼猴腸、肺、