基于蛋白質組學的肺結核靶向造影劑的分子靶標研究.pdf

1、目的:
　　建立結核桿菌急性肺感染的動物模型，探討小鼠肺結核在感染不同時期的micro-CT(micro-computer tomography)表現(xiàn)及其病理的動態(tài)演變。根據(jù)對不同感染時期肺組織內結核桿菌和宿主的蛋白質組學的分析結果，篩選特異蛋白質作為分子靶標，為制備肺結核靶向CT造影劑提供理論基礎。
　　方法:
　　應用結核分枝桿菌H37Rv標準株菌懸液以滴鼻法建立C57BL/6J小鼠急性肺結核模型，同時設SPF級健

2、康對照組。分別在感染第1、4、8、12周后進行micro-CT掃描;經心臟灌流后處死小鼠，取1/4肺組織勻漿進行結核桿菌培養(yǎng);1/4肺組織勻漿進行蛋白質組學分析，分別用于篩選結核桿菌和宿主的分子標記物;1/4肺組織-80℃凍存用于RT-PCR(Real time polymerase chain reaction)驗證;余1/4肺組織進行組織病理學分析。
　　通過已建立的小鼠肺結核模型，探討感染不同時期的病理改變及其micro-C

3、T動態(tài)演變特征（正文第一部分重點闡述）。
　　采用鳥槍法液相色譜串聯(lián)質譜法(shotgun liquid chromatography-tandem massspectrometry，shotgun LC-MS/MS)分析肺組織中結核桿菌的特異蛋白質:經質譜分析，搜索結核分支桿菌蛋白質組數(shù)據(jù)庫，得到結核桿菌表達的蛋白質組。對這些蛋白質進行功能學分類分析，選擇與結核桿菌生長密切相關的細胞膜或細胞壁蛋白質，作為制備靶向造影劑的潛在分子

4、靶標（正文第二部分重點闡述）。
　　采用二維凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2DE）結合LC-MS/MS技術分析肺結核的差異蛋白質組:將獲得4組2DE膠，進行圖像差異分析、挖點酶解、質譜鑒定并搜索小鼠和結核桿菌蛋白質組數(shù)據(jù)庫，分析差異蛋白質的表達量在不同感染時間點的變化，篩選用于結核病特異診斷的分子靶標，并進行Western Blot和RT-PCR驗證（正文第三部分重點闡述）。

5、r>　　結果:
　　1.攻毒40只小鼠，共計死亡9只，肺內未出現(xiàn)陽性病灶者3只，剔除實驗組，實際第1、2、3、4組每組實驗小鼠數(shù)目分別為7只、6只、8只、7只，共28只。
　　2.micro-CT——病理對照分析:感染1周后，急性感染造成大面積肺泡滲出，micro-CT表現(xiàn)為大片磨玻璃密度影，鏡下見肺泡間隔增寬，淋巴細胞浸潤為主，散在中性粒細胞、巨噬細胞和類上皮細胞;感染4周后，鏡下可見巨噬細胞和泡沫細胞大量聚集，散在類上皮

6、細胞、多核巨細胞和泡沫細胞，micro-CT表現(xiàn)為大小不等斑片樣實變，邊界不清;感染8周后，實變范圍增大，類上皮細胞增多，開始出現(xiàn)多核巨細胞聚集成團，有結核肉芽腫形成趨勢;感染12周后，滲出減少、多發(fā)孤立的肉芽腫形成，或者病變范圍進一步進展。感染1、4、8、12周后肺內結核桿菌培養(yǎng)計數(shù)結果分別為（單位:log10 cfu）:6.30±0.02，6.61±0.40，6.38±0.25,4.52±0.32。
　　3.鳥槍法LC-MS/

7、MS蛋白質組學分析結果:感染4、8、12周的肺結核蛋白質樣本鑒定出的蛋白質分別為102，101，90個，共計237個蛋白質（根據(jù)病理分析，感染1周時肺內為非特異性滲出，故未計入）。在組間重復表達的有43個，占18.2％，其中3個時間點均存在的蛋白質有11個，感染4周和8周重復鑒定的蛋白質12個，感染8周和12周重復鑒定20個，而感染4周和感染12周僅重復鑒定出2個。重復鑒定出的蛋白質按功能分類，第7類（細胞代謝中間產物）最多;其次是第2

8、類（信號通路蛋白）和第9類（調控蛋白）。選擇其中感染8周和感染12周重復表達且為細胞膜蛋白質，近年來備受關注的第9類蛋白質中的結核分支桿菌雙因子系統(tǒng)中的MtrB進行重點研究，發(fā)現(xiàn)結核桿菌的膜蛋白質MtrB可以成為制備結核靶向造影劑的潛在靶標。
　　4.分析4組2DE膠，感染第1、4、8、12周得到的差異表達的蛋白質膠點數(shù)目分別為11個，154個，254個和30個，各組間差異點重疊性分析，在4組間，3組間，和兩組間均為差異表達的蛋白

9、質膠點分別為0個，14個和75個。
　　選取了145個表達差異點進行膠內酶解，將MS/MS的結果搜小鼠蛋白質數(shù)據(jù)庫，145個蛋白質點對應了82種準確鑒定的非冗余蛋白質。對82種蛋白質進行蛋白質間相互作用網絡圖分析得出節(jié)點蛋白質有:Alb，Vim，Actb， Fthl，Tnnt3，F(xiàn)tl，Msn等;結合二維凝膠電泳分析的差異倍數(shù)比較并查閱文獻，發(fā)現(xiàn)鐵蛋白H鏈和L鏈在感染1周時無差異表達，在感染4、8、12周時均有表達上調，且呈拋物線

10、式上調表達，在感染8周時達到峰值。
　　5.將2DE-MS/MS分析得到的結果，搜結核桿菌蛋白質數(shù)據(jù)庫，鑒定得到評分大于36分的僅7種蛋白質，包括:SYA，CP126，HTPG，Y224，SMC，ACEA。
　　結論:
　　1.滴鼻法建立的C57BL/6J小鼠急性感染肺結核動物模型，肺活菌計數(shù)，micro-CT和組織病理學結果均表明模型制備成功。
　　2.急性小鼠肺結核模型的肺部micro-CT表現(xiàn)隨疾病發(fā)展有一

11、定的變化規(guī)律:早期大片GGO——大小不等實變灶——大范圍實變和較大、邊界不清的結節(jié)（肉芽腫）——實變進一步發(fā)展，或實變有所吸收，僅散在多個小結節(jié)。這些征象反映了小鼠肺結核病理改變，可用于監(jiān)測小鼠肺結核的病程，提示在未來的結核動物實驗中可減少小鼠不必要的處死。
　　3.活體組織內初步篩選出結核分支桿菌表達的蛋白質MtrB(Rv3245c)可作為制備CT靶向造影劑的潛在分子靶標，為抗MtrB鼠單克隆抗體制備靶向CT對比劑的制備及動物模