縫隙連接蛋白43 Ser368位點(diǎn)磷酸化水平變化在ET-1誘導(dǎo)的腦血管痙攣中作用的研究.pdf

1、目的:
　　目前研究表明，Cx43 Ser368位點(diǎn)磷酸化狀態(tài)對(duì)Cx43縫隙連接通道功能有著重要的影響，此位點(diǎn)磷酸化可通過調(diào)節(jié)Cx43蛋白的代謝過程以及Cx43通道的通透性和電導(dǎo)率等，調(diào)節(jié)縫隙連接通道功能。通過枕大池穿刺二次注血方法構(gòu)建的蛛網(wǎng)膜下腔出血模型中，運(yùn)用特異性抗Cx43 Ser368磷酸化抗體檢測(cè)痙攣腦血管中蛋白表達(dá)情況時(shí)發(fā)現(xiàn):Cx43 Ser368位點(diǎn)磷酸化水平與腦血管痙攣程度成正相關(guān)。為此，本次實(shí)驗(yàn)旨在改變腦血管壁細(xì)

2、胞中Cx43 Ser368位點(diǎn)的磷酸化水平，觀察Cx43 Ser368位點(diǎn)磷酸化水平的改變對(duì)腦血管痙攣程度的影響。通過上述研究進(jìn)一步明確蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的病理機(jī)制，為預(yù)防和治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣疾病尋找新的有效方法。
　　方法:
　　1、構(gòu)建Cx43 Ser368A慢病毒載體:以pCMV-Cx43 cDNA質(zhì)粒為模板克隆出目的基因Cx43 cDNA，并應(yīng)用PCR技術(shù)定點(diǎn)突變Cx43 Ser368位點(diǎn)。運(yùn)用G

3、ateway技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)載體PLV.Ex3d.p/neo-EF1 AIRES/EGFP質(zhì)粒。篩選陽(yáng)性質(zhì)粒并測(cè)序鑒定，將含有突變Cx43 Ser368A基因的目的質(zhì)粒和病毒輔助質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體包裹后共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞EGFP表達(dá)情況，通過結(jié)晶紫染色法檢測(cè)產(chǎn)生病毒液的滴度。
　　2、構(gòu)建慢病毒感染腦基底動(dòng)脈模型:運(yùn)用枕大池穿刺注射方法向SD大鼠腦池內(nèi)注入慢病毒液對(duì)SD

4、大鼠進(jìn)行造模，于造模后的14天、28天處死動(dòng)物，取腦基底動(dòng)脈快速冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察腦基底動(dòng)脈各層組織中EGFP的表達(dá)情況，并對(duì)模型全腦行連續(xù)石蠟切片，HE染色后行光鏡檢查，以確認(rèn)慢病毒是否引起組織炎癥、壞死等。
　　3、慢病毒感染對(duì)ET-1所致腦血管痙攣影響:在建模后最佳感染時(shí)期對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后斷頭取腦。將基底動(dòng)脈制成動(dòng)脈環(huán)和動(dòng)脈條，用不同濃度的ET-1刺激血管環(huán)，應(yīng)用生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)觀測(cè)血管環(huán)張力的變化。動(dòng)脈條經(jīng)相同

5、刺激程序后，通過Wersten blotting技術(shù)對(duì)血管條中Cx43蛋白以及Cx43 Ser368位點(diǎn)磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1、PLV.Ex3 d.p/neo-EF1 AIRES/EGFP產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，其大小與理論值相符。質(zhì)粒行DNA測(cè)序顯示載體中目的基因序列與GenBank提供的大鼠Cx43基因編碼序列子cDNA全序列一致（除突變位點(diǎn)），Cx43基因突變位點(diǎn)與設(shè)計(jì)相符，證明

6、PLV.Ex3d.p/neo-EF1AIRES/EGFP質(zhì)粒構(gòu)建成功。病毒包裝48小時(shí)后熒光顯微鏡觀察可見細(xì)胞中有大量EGFP表達(dá)，表明轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中產(chǎn)生病毒，結(jié)晶紫染色法檢測(cè)收集的病毒濃縮液滴度為9.7×107TU/ml。
　　2、腦基底動(dòng)脈快速冰凍切片后熒光顯微鏡下觀察顯示:在注射慢病毒后的14天和28天后，腦基底動(dòng)脈壁三層組織中均有EGFP的表達(dá)，且在感染28天后的腦基底動(dòng)脈中觀察到的EGFP最強(qiáng)。感染28

7、天后的腦基底動(dòng)脈經(jīng)石蠟切片HE染色，在普通光鏡顯微鏡下觀察顯示:腦基底動(dòng)脈壁各層組織未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管壁各層細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞大小形態(tài)正常，細(xì)胞核完整，無(wú)核碎裂核溶解等現(xiàn)象，細(xì)胞無(wú)水腫、溶解、壞死，血管壁未見瘢痕形成，無(wú)纖維組織增生。
　　3、經(jīng)各濃度ET-1刺激后，慢病毒感染組和正常組血管環(huán)的張力均有增強(qiáng)，呈濃度依賴性。在ET-1刺激濃度達(dá)到1×10-8 mol/L及以上時(shí)，慢病毒組血管環(huán)張力增強(qiáng)的幅度逐漸較正常組明顯(

8、P＜0.05)。
　　4、檢測(cè)ET-1刺激后的腦基底動(dòng)脈中Cx43蛋白表達(dá)及其磷酸化水平顯示:正常腦基底動(dòng)脈壁細(xì)胞中存在Cx43表達(dá)，而且Cx43 Ser368位點(diǎn)保持較低磷酸化水平。溶媒組與正常組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。正常腦基底動(dòng)脈經(jīng)ET-1刺激后，Cx43表達(dá)明顯上升，而且Cx43 Ser368位點(diǎn)的磷酸化水平也伴隨著上升。與正常組比較兩檢測(cè)指標(biāo)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。經(jīng)慢病毒感染后，腦基底動(dòng)脈壁細(xì)胞中

9、Cx43表達(dá)上升，但Cx43 Ser368位點(diǎn)磷酸化水平被明顯抑制。與正常組比較兩檢測(cè)指標(biāo)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。慢病毒感染后的腦基底動(dòng)脈經(jīng)ET-1刺激后，Cx43表達(dá)明顯上升，但Cx43 Ser368位點(diǎn)磷酸化水平仍然被明顯抑制。與正常刺激組比較Cx43 Ser368位點(diǎn)磷酸化水平有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　Cx43 Ser368位點(diǎn)磷酸化水平的降低可導(dǎo)致腦血管對(duì)致痙因子的致痙作用反應(yīng)增強(qiáng)。