縫隙連接蛋白43 Ser368位點磷酸化參與腦血管痙攣的體外實驗研究.pdf

1、目的:
　　縫隙連接通道(GJ)介導(dǎo)的細胞間信號通訊(GJIC)是相鄰細胞間電化學(xué)信號傳遞的最直接的通路，在血管協(xié)同舒縮的調(diào)節(jié)過程中起重要作用，其中縫隙連接蛋白43(Cx43)在血管壁分布最廣泛，并主要通過磷酸化過程實現(xiàn)構(gòu)象及功能的調(diào)節(jié)，前期體內(nèi)實驗研究表明在Cx43蛋白及其磷酸化水平與實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后腦血管痙攣(CVS)的病理過程關(guān)系密切，本實驗在此基礎(chǔ)上，在體外細胞模型中進一步研究縫隙連接蛋白Cx43 Ser3

2、68位點磷酸化水平的改變在腦血管痙攣病理過程中可能的作用機制。
　　材料與方法:
　　1.原代培養(yǎng)與鑒定SD-大鼠基底動脈平滑肌細胞:無菌條件下迅速分離取出基底動脈，輕柔去除外膜和內(nèi)膜，采用組織貼塊法培養(yǎng)平滑肌細胞，光學(xué)相差顯微鏡觀察細胞生長、細胞化學(xué)免疫熒光鑒定。
　　2.建立實驗性腦血管痙攣細胞模型:原代培養(yǎng)的平滑肌細胞培養(yǎng)基中加入終濃度為10-6M OxyHb孵育24h、48h、72h、96h建立腦血管痙攣不同時

3、段的細胞模型，通過隨機雙盲的方法，光學(xué)顯微鏡下測定平滑肌細胞的平均長度變化，并應(yīng)用western blot檢測細胞表型分子α-actin、calponin、OPN的表達變化來反應(yīng)細胞收縮狀態(tài)的改變，并檢測Cx43總蛋白(T-Cx43)以及其Ser368位點磷酸化(P-Cx43)的比例水平改變，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差記錄結(jié)果，采用t檢驗，進行統(tǒng)計分析。
　　3.Cx43 S368位點突變的慢病毒載體構(gòu)建及鑒定:以pCMV-Cx43cDNA質(zhì)粒

4、為模板克隆出目的基因Cx43cDNA，并應(yīng)用PCR技術(shù)定點突變Cx43 S368位點基因，再構(gòu)建PLV.Ex3 d.p/neo-EF1 A(<)Cx43(>)IRES/EGFP真核表達載體質(zhì)粒。測序鑒定后，以陽性目的質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝產(chǎn)生慢病毒，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的293T細胞，并應(yīng)用結(jié)晶紫染色法檢測病毒滴度。
　　4.體外實驗研究Cx43 Ser368位點突變對腦血管痙攣的影響:病毒載體感染平滑肌細胞效

5、率檢測，首先比較不同MOI值對細胞的感染效率的影響，其次觀察24h、48h、72h、96h不同時間點的細胞感染效率，最后以最優(yōu)MOI和最佳時間點感染平滑肌細胞，并檢測蛋白水平的感染效率。實驗分組為1）病毒組+OxyHb，2)空載病毒組+OxyHb，3）未感染+OxyHb，4）正常對照組（各組分別設(shè)置），觀察相應(yīng)時間點細胞收縮程度的變化，同時通過對收縮標(biāo)記分子α-actin、calponin進行western blot檢測進一步佐證細胞的

6、收縮狀態(tài)變化，同前檢測T-Cx43表達及其中P-Cx43的變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.原代培養(yǎng)的基底動脈平滑肌細胞經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及特異性抗α-actin抗體免疫熒光鑒定為平滑肌細胞并且純度達到95％以上。
　　2.成功構(gòu)建OxyHb誘導(dǎo)的腦血管痙攣細胞模型:細胞長度分別為正常時的69.26±19.23μm、24h為40.57±12.18μm、48h為29.98±20.19μm、72h為35.87±19.56μm、96

7、h為42.25±17.94μm，即OxyHb能夠誘導(dǎo)平滑肌細胞的收縮，且收縮程度隨著孵育時間增加在48h時達到高峰，之后隨著時間遞增而逐步緩解，Western blot檢測標(biāo)記分子其中收縮型標(biāo)記分子α-actin、calponin隨著時間變化逐漸升高到48h時達到最大量分別為194.9％±20.9％（孵育前125.6％±20.5％），37.4％±7.8％（孵育前13.8％±9.3％），72h、96h則均逐漸降低其與細胞收縮程度的相關(guān)系數(shù)

8、分別為-0.879和-0.945;合成型標(biāo)記分子OPN相對表達量逐漸降低在48h時達到最小量7.4％±9.2％（孵育前26.7％±15.2），之后緩慢升高相關(guān)系數(shù)為0.957，說明標(biāo)記分子的相對表達量能夠很好證明細胞收縮程度的改變。且經(jīng)過隨著時間的遞增T-Cx43的表達量逐漸升高并在48h時達到最高峰75.8％±4.1％（孵育前27.6％±18.5％），72h、96h較前(48h)逐漸下降，但仍高與正常對照水平，而P-Cx43的表達前期

9、無明顯變化，而從48h開始隨著時間的遞增其表達量明顯升高，72h達到高峰49.2％±10.8（孵育前10.5％±16.3），在96h時仍有高峰表達較前(72h)略有下降，即P-Cx43占Cx43總蛋白的相對比在48h前不斷降低，到48h達到最小值，而之后則逐步升高。
　　3.DNA測序表明成功構(gòu)建PLV.Ex3d.p/neo-EF1 A(<)Cx43(>)IRES/EGFP質(zhì)粒，Cx43 S368位點堿基成功突變?yōu)楸磉_丙氨酸的堿基

10、;熒光檢測顯示轉(zhuǎn)染的293T細胞成功產(chǎn)生慢病毒，病毒濃縮懸液滴度測定為9.7x107TU/ml。
　　4.體外實驗研究Cx43 Ser368位點突變對腦血管痙攣的影響結(jié)果:病毒感染平滑肌細胞效率檢測:MOI值取100時，細胞的感染效率最高，且對細胞的生長無明顯影響，自感染起24h左右即可觀察到綠色熒光，到72h時達到高峰，感染率98％以上，且維持穩(wěn)定，經(jīng)Western blot檢測P-Cx43在突變組72h之后處于低水平表達，說明

11、感染效率在蛋白表達水平達到預(yù)期效果。突變組在OxyHb孵育后，細胞的長度變化24h(36.4±16.36μm)、48h(28.73±9.53μm)組與對照組24h為（38.64±16.32μm）、48h(30.96±19.98μm)無明顯差異，而72h(28.12±14.66μm)組和96h(30.14±20.42μm)突變組的長度則明顯小于對照組72h(36.46±17.53μm)、96h(45.34±17.94μm)，標(biāo)記分子的蛋白

12、相對表達量與細胞平均長度變化結(jié)果相符，而突變組中T-Cx43的表達較對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，突變組P-Cx43也有升高但明顯低于對照組，即P-Cx43占Cx43總蛋白的相對比前期無明顯差異，但48h后一直處于較低值。
　　結(jié)論:
　　1.OxyHb孵育會誘導(dǎo)T-Cx43和P-Cx43表達升高，但時相性不同。
　　2.成功構(gòu)建了表達Cx43 S368位點突變的慢病毒載體。
　　3.通過病毒感染特異性突變Cx43的主要磷