基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對微環(huán)境的調(diào)控作用影響皮膚瘢痕形成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、當(dāng)皮膚受到較重?fù)p傷后，在受到各種內(nèi)外源性致病原（氧自由基、病毒、細(xì)菌、粉塵等）刺激下，免疫系統(tǒng)被激活，發(fā)生炎癥反應(yīng)以抵抗外來損傷，或使其愈合過程減慢或發(fā)生不良的愈合結(jié)果（例如增生性瘢痕和瘢痕疙瘩），仍是臨床亟待解決的難題之一。盡管目前促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)和抑制過度瘢痕形成的治療方法有很多，但是，在促愈和瘢痕治療之間還存在著一定的矛盾:如生長因子類促愈合治療的同時(shí)具有加重瘢痕形成的風(fēng)險(xiǎn)。目前對于皮膚瘢痕的治療方法有其局限性，治療效果不好，有的副作

2、用大甚至影響愈合。因此，尋求一種新的皮膚瘢痕治療方法，既不會影響愈合的效果，又能抑制瘢痕的形成，這對于易形成瘢痕的燙傷、燒傷、嚴(yán)重外傷等創(chuàng)傷的治療有著十分重要的意義。
　　隨著對干細(xì)胞認(rèn)識的深入和相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，為解決這一臨床難題帶來了希望。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是細(xì)胞療法中重要的成員之一，具有來源廣泛、取材方便、低免疫原性以及可自體移植等優(yōu)勢。目前已有研究證實(shí)MSCs可通過多種調(diào)節(jié)機(jī)制在創(chuàng)傷愈合過程中發(fā)揮其治療作用，大多學(xué)者認(rèn)

3、為，MSCs在此過程中通過分泌各種生物活性因子而發(fā)揮作用。在動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中發(fā)現(xiàn)，MSCs能夠促進(jìn)心肌梗死后心肌功能的修復(fù)，并且減少了瘢痕形成面積，對肺纖維化也有一定的治療作用，這些均給纖維化性疾病的治療帶來了希望。但MSCs是否對于皮膚瘢痕的修復(fù)也起作用呢？是否也是通過分泌的生物活性因子起作用呢？至今尚無明確的研究報(bào)道。
　　本研究通過建立體外和體內(nèi)模擬瘢痕形成的微環(huán)境,研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)在此方面的作用，

4、分兩個(gè)部分進(jìn)行如下研究:
　　1.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　(1)全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(HBM-MSCs)，并進(jìn)行鑒定擴(kuò)增;
　　(2)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及擴(kuò)增;
　　(3)將制備的HBM-MSCs條件培養(yǎng)液作用于原代培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，觀察對其增殖能力及膠原產(chǎn)生的影響;
　　(4)篩選在HBM-MSCs抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞

5、增殖及膠原產(chǎn)生過程中的關(guān)鍵蛋白，初步探討B(tài)M-MSCs抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的分子機(jī)制。
　　2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞影響創(chuàng)面瘢痕形成作用的研究
　　(1)采用博來霉素皮下局部注射的方法構(gòu)建小鼠漸進(jìn)性皮膚瘢痕動物模型;
　　(2)分離、培養(yǎng)、鑒定、擴(kuò)增綠色熒光(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠的BM-MSCs。依托此自行構(gòu)建的動物模型，示蹤BM-MSCs在體內(nèi)存活時(shí)間和分布，進(jìn)一步探索MSCs在皮膚瘢痕形成中的作用。
　　(3)

6、初步探討B(tài)M-MSCs在調(diào)控皮膚瘢痕形成的過程中的作用機(jī)制，評價(jià)其作為新型細(xì)胞療法抑制瘢痕形成的可行性。
　　主要結(jié)果與結(jié)論如下:
　　1.HBM-MSCs的條件培養(yǎng)液作為刺激因子孵育瘢痕成纖維細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBM-MSCs可抑制此細(xì)胞的增殖、分化，在基因和蛋白水平上的檢測中發(fā)現(xiàn)HBM-MSCs可以抑制膠原的合成。
　　2.篩選HBM-MSCs分泌成分中抗纖維化的生物活性因子，在篩選過程中確定轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)家族

7、蛋白高表達(dá)，并且在炎癥因子刺激下，TGF-β1和TGF-β3的分泌顯著增強(qiáng);
　　3.將HBM-MSCs分泌的關(guān)鍵蛋白用相應(yīng)抗體中和會降低HBM-MSCs對瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制作用。
　　4.采用GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的BM-MSCs移植入瘢痕模型體內(nèi)，采用熒光示蹤和tunel凋亡檢測發(fā)現(xiàn)BM-MSCs在體內(nèi)的作用時(shí)間很短，為24小時(shí)左右。
　　5.BM-MSCs可以抑制小鼠漸進(jìn)性皮膚瘢痕模型中瘢痕的形成，在瘢痕樣本中對抗纖

8、維化的關(guān)鍵蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，在動物模型中BM-MSCs可以直接分泌抗纖維化的蛋白發(fā)揮抑制瘢痕形成的作用。
　　以上研究結(jié)果表明，MSCs可以分泌抗纖維化的生物活性因子，通過一系列的調(diào)節(jié)作用包括抑制炎性因子、成纖維細(xì)胞的增殖和分化、膠原的產(chǎn)生以及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積等，調(diào)節(jié)組織修復(fù)的微環(huán)境，在博來霉素誘導(dǎo)的小鼠漸進(jìn)性皮膚瘢痕動物模型中抑制了瘢痕的進(jìn)展，并且此種作用可能與MSCs調(diào)節(jié)TGF-β家族在瘢痕形成過程的作用密切相關(guān)，TGF-β3在此

9、過程中有積極的調(diào)控作用，至少是部分作用。值得我們注意的是，盡管由BM-MSCs分泌的TGF-β3確實(shí)具有抗纖維化的作用，但絕不是在減輕皮膚纖維化、促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程唯一的活性因子，可能是BM-MSCs分泌的活性因子發(fā)揮的協(xié)同作用。最重要的是，本研究表明對于皮膚瘢痕形成干預(yù)性的治療是有效的，但是這種作用是否存在普遍性和穩(wěn)定性以及其具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討，明確MSCs在皮膚瘢痕方面的作用機(jī)制，為其今后在臨床上的應(yīng)用推廣提供基礎(chǔ)理論和