基于骨髓間充質(zhì)干細胞對微環(huán)境的調(diào)控作用影響皮膚瘢痕形成的實驗研究.pdf

1、當皮膚受到較重損傷后，在受到各種內(nèi)外源性致病原（氧自由基、病毒、細菌、粉塵等）刺激下，免疫系統(tǒng)被激活，發(fā)生炎癥反應以抵抗外來損傷，或使其愈合過程減慢或發(fā)生不良的愈合結果（例如增生性瘢痕和瘢痕疙瘩），仍是臨床亟待解決的難題之一。盡管目前促進創(chuàng)傷修復和抑制過度瘢痕形成的治療方法有很多，但是，在促愈和瘢痕治療之間還存在著一定的矛盾:如生長因子類促愈合治療的同時具有加重瘢痕形成的風險。目前對于皮膚瘢痕的治療方法有其局限性，治療效果不好，有的副作

2、用大甚至影響愈合。因此，尋求一種新的皮膚瘢痕治療方法，既不會影響愈合的效果，又能抑制瘢痕的形成，這對于易形成瘢痕的燙傷、燒傷、嚴重外傷等創(chuàng)傷的治療有著十分重要的意義。
　　隨著對干細胞認識的深入和相關技術的發(fā)展，為解決這一臨床難題帶來了希望。間充質(zhì)干細胞(MSCs)是細胞療法中重要的成員之一，具有來源廣泛、取材方便、低免疫原性以及可自體移植等優(yōu)勢。目前已有研究證實MSCs可通過多種調(diào)節(jié)機制在創(chuàng)傷愈合過程中發(fā)揮其治療作用，大多學者認

3、為，MSCs在此過程中通過分泌各種生物活性因子而發(fā)揮作用。在動物實驗和臨床研究中發(fā)現(xiàn)，MSCs能夠促進心肌梗死后心肌功能的修復，并且減少了瘢痕形成面積，對肺纖維化也有一定的治療作用，這些均給纖維化性疾病的治療帶來了希望。但MSCs是否對于皮膚瘢痕的修復也起作用呢？是否也是通過分泌的生物活性因子起作用呢？至今尚無明確的研究報道。
　　本研究通過建立體外和體內(nèi)模擬瘢痕形成的微環(huán)境,研究骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)在此方面的作用，

4、分兩個部分進行如下研究:
　　1.人骨髓間充質(zhì)干細胞對增生性瘢痕成纖維細胞影響的實驗研究
　　(1)全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞(HBM-MSCs)，并進行鑒定擴增;
　　(2)增生性瘢痕成纖維細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及擴增;
　　(3)將制備的HBM-MSCs條件培養(yǎng)液作用于原代培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細胞，觀察對其增殖能力及膠原產(chǎn)生的影響;
　　(4)篩選在HBM-MSCs抑制增生性瘢痕成纖維細胞

5、增殖及膠原產(chǎn)生過程中的關鍵蛋白，初步探討B(tài)M-MSCs抑制增生性瘢痕成纖維細胞的分子機制。
　　2.骨髓間充質(zhì)干細胞影響創(chuàng)面瘢痕形成作用的研究
　　(1)采用博來霉素皮下局部注射的方法構建小鼠漸進性皮膚瘢痕動物模型;
　　(2)分離、培養(yǎng)、鑒定、擴增綠色熒光(GFP)轉基因小鼠的BM-MSCs。依托此自行構建的動物模型，示蹤BM-MSCs在體內(nèi)存活時間和分布，進一步探索MSCs在皮膚瘢痕形成中的作用。
　　(3)

6、初步探討B(tài)M-MSCs在調(diào)控皮膚瘢痕形成的過程中的作用機制，評價其作為新型細胞療法抑制瘢痕形成的可行性。
　　主要結果與結論如下:
　　1.HBM-MSCs的條件培養(yǎng)液作為刺激因子孵育瘢痕成纖維細胞，結果發(fā)現(xiàn)HBM-MSCs可抑制此細胞的增殖、分化，在基因和蛋白水平上的檢測中發(fā)現(xiàn)HBM-MSCs可以抑制膠原的合成。
　　2.篩選HBM-MSCs分泌成分中抗纖維化的生物活性因子，在篩選過程中確定轉化生長因子(TGF)家族

7、蛋白高表達，并且在炎癥因子刺激下，TGF-β1和TGF-β3的分泌顯著增強;
　　3.將HBM-MSCs分泌的關鍵蛋白用相應抗體中和會降低HBM-MSCs對瘢痕成纖維細胞的抑制作用。
　　4.采用GFP轉基因小鼠的BM-MSCs移植入瘢痕模型體內(nèi)，采用熒光示蹤和tunel凋亡檢測發(fā)現(xiàn)BM-MSCs在體內(nèi)的作用時間很短，為24小時左右。
　　5.BM-MSCs可以抑制小鼠漸進性皮膚瘢痕模型中瘢痕的形成，在瘢痕樣本中對抗纖

8、維化的關鍵蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，在動物模型中BM-MSCs可以直接分泌抗纖維化的蛋白發(fā)揮抑制瘢痕形成的作用。
　　以上研究結果表明，MSCs可以分泌抗纖維化的生物活性因子，通過一系列的調(diào)節(jié)作用包括抑制炎性因子、成纖維細胞的增殖和分化、膠原的產(chǎn)生以及細胞外基質(zhì)的沉積等，調(diào)節(jié)組織修復的微環(huán)境，在博來霉素誘導的小鼠漸進性皮膚瘢痕動物模型中抑制了瘢痕的進展，并且此種作用可能與MSCs調(diào)節(jié)TGF-β家族在瘢痕形成過程的作用密切相關，TGF-β3在此

9、過程中有積極的調(diào)控作用，至少是部分作用。值得我們注意的是，盡管由BM-MSCs分泌的TGF-β3確實具有抗纖維化的作用，但絕不是在減輕皮膚纖維化、促進皮膚創(chuàng)傷修復過程唯一的活性因子，可能是BM-MSCs分泌的活性因子發(fā)揮的協(xié)同作用。最重要的是，本研究表明對于皮膚瘢痕形成干預性的治療是有效的，但是這種作用是否存在普遍性和穩(wěn)定性以及其具體的作用機制尚需進一步探討，明確MSCs在皮膚瘢痕方面的作用機制，為其今后在臨床上的應用推廣提供基礎理論和