雞MDA5信號通路在IBDV致雛雞法氏囊病理損傷中的作用研究.pdf

1、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)為dsRNA病毒，可造成感染雛雞法氏囊損傷而導致雛雞發(fā)生免疫抑制。本試驗以14日齡SPF雛雞為研究對象，從特異性識別dsRNA病毒的模式識別受體MDA5入手，應用分子生物學以及組織病理學檢測技術(shù)對IBDV感染雛雞法氏囊內(nèi)chMDA5及其信號轉(zhuǎn)導通路信號分子的表達、IBDV含量及法氏囊病理形態(tài)學變化進行研究，以其明確chMDA5信號通路在IBDV感染雛雞法氏囊損傷機制中的作用。
　　首先，提取IBDV感

2、染雛雞法氏囊總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過反轉(zhuǎn)錄PCR方法克隆出IBDV VP2全長基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-VP2，通過大腸桿菌表達系統(tǒng)誘導表達得到蛋白并進行純化，制備兔抗IBDV VP2多克隆抗體，經(jīng)ELISA、Western blot及間接免疫熒光方法鑒定，此多抗具有較好的特異性和反應性。
　　之后，采用實時熒光定量PCR法、間接免疫熒光技術(shù)及傳統(tǒng)病理學技術(shù)對IBDV標準株及IBD中等毒力活疫苗感染/免疫雛雞法氏

3、囊內(nèi)IBDV含量及其病理形態(tài)學變化進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩試驗組雛雞法氏囊內(nèi)IBDV含量及其VP2蛋白表達趨勢均較一致，均從感染后1d大量表達，至感染后4d達到峰值(P＜0.01)，隨后開始下調(diào)，感染組至感染后35 d接近對照水平，疫苗組至免疫后21d接近對照水平。雛雞感染IBDV標準株后1-7 d，法氏囊眼觀病理變化為不同程度的萎縮，有黃色膠凍樣物質(zhì)滲出，內(nèi)部充滿黏液以及出血現(xiàn)象，感染后21、35 d法氏囊僅表現(xiàn)為萎縮;免疫IBD中等毒

4、力活疫苗后僅見法氏囊輕微萎縮并在后期逐漸恢復。雛雞感染IBDV標準株后1-7 d其病理組織學變化表現(xiàn)為急性炎癥變化，即大量淋巴細胞壞死、崩解，中性粒細胞、巨噬細胞浸潤，網(wǎng)狀細胞數(shù)量增多，充血或出血，間質(zhì)結(jié)締組織增生，感染后35 d其淋巴濾泡面積仍小于對照雛雞;免疫IBD中等毒力活疫苗后，上述病理變化均輕微，且至免疫后21 d基本恢復正常水平。
　　同時，采用實時熒光定量PCR法、間接免疫熒光技術(shù)對雛雞法氏囊內(nèi)chMDA5及其信號轉(zhuǎn)

5、導通路銜接蛋白分子(chIPS-1)、轉(zhuǎn)錄因子(chIRF3、chNF-κB)、誘導產(chǎn)物即細胞因子（chIFN-β、chTNF-α、chIL-1β和chIL-6）的表達變化進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染IBDV標準株雛雞法氏囊內(nèi)chMDA5 mRNA與蛋白表達、chIPS-1、chIRF3、chNF-κB、chIFN-β、chTNF-α、chIL-1β和chIL-6mRNA表達量均從感染后1d開始明顯升高，至感染后4d達到峰值（P＜0.01）

6、，隨后開始下調(diào)，之后逐漸恢復正常水平。免疫IBD中等毒力活疫苗雛雞法氏囊內(nèi)上述分子表達規(guī)律與感染組基本一致，但上調(diào)水平均低于感染組。
　　上述結(jié)果表明，IBDV能夠激活雛雞法氏囊內(nèi)chMDA5信號通路，參與IBDV感染雛雞過程，且chMDA5信號通路活化程度與IBDV毒力正相關(guān);IBDV激活雛雞法氏囊內(nèi)chMDA5信號轉(zhuǎn)導通路，誘導促炎性細胞因子的釋放，導致法氏囊組織發(fā)生損傷，并且其損傷程度與chMDA5信號轉(zhuǎn)導通路活化程度相關(guān)。