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文檔簡介
1、目的:1、分析小鼠卵巢生發(fā)泡(germinal vesicle,GV)期卵母細(xì)胞的核質(zhì)比,探討核質(zhì)比在卵母細(xì)胞成熟發(fā)育中的作用;2、分析GV期卵母細(xì)胞線粒體ATP合酶亞基8(ATP8)的表達(dá)及其生物信息學(xué)數(shù)據(jù),研究卵母細(xì)胞成熟與線粒體功能的關(guān)系;3、構(gòu)建ATP8基因的RNA干擾載體,為研究ATP8基因在卵母細(xì)胞成熟發(fā)育過程中的作用及其對卵母細(xì)胞發(fā)育參數(shù)-核質(zhì)比的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。 方法:1、用擠壓法從卵巢中分離獲得GV期卵母細(xì)胞并置
2、leica Mps 60倒置顯微鏡下拍照,測量系統(tǒng)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)圖片校正后,測量GV期卵母細(xì)胞面積和半徑,按核質(zhì)比(nucleus-plasma ratio,NP)公式:NP=V<,N>/(V<,c>-V<,N>),式中V<,N>為核的體積,V<,c>為細(xì)胞的體積,由V=4/3pr<'3>分別求得,計(jì)算出GV期卵母細(xì)胞的核質(zhì)比;2、以Genbank(NC 005089)公布的線粒體ATP8序列為參考,設(shè)計(jì)兩對引物,用RT-PCR檢測GV期單個(gè)卵
3、母細(xì)胞中ATP8基因的表達(dá):其中,cDNA的合成分兩種方法進(jìn)行:一是將GV期單個(gè)卵母細(xì)胞直接進(jìn)行RT合成cDNA,二是先用DNA酶加EcoR Ⅰ酶祛除mtDNA和核DNA后再進(jìn)行RT;回收產(chǎn)物構(gòu)建克隆質(zhì)粒并測序;3、用Blastn、VECTOR NIT 9.0、RNAdraw、 Treeview等工具對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析,在此基礎(chǔ)上用RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子表達(dá)siRNA法構(gòu)建ATP8的RNA干擾載體。 結(jié)果:1、分離獲得G
4、V期卵母細(xì)胞51枚,測得卵徑為40.940±3.341 μm,核徑為15.020±2.236μm,其核質(zhì)比為0.054±0.019;2、RT-PCR結(jié)果顯示ATP8基因在GV期卵母細(xì)胞中表達(dá)。克隆測序顯示所測昆明小鼠ATP8序列與Genbank序列完全一致;3、blastp序列比對和mRNA二級結(jié)構(gòu)圖均顯示12種動(dòng)物間的ATP8氨基酸序列和ATP8核酸序列有較大差異,其中不同品種小鼠問也有差異;4、不同物種ATP8核苷酸序列構(gòu)建出的分子
5、進(jìn)化樹中,小鼠與棕熊進(jìn)化距離較遠(yuǎn),與田鼠、家貓進(jìn)化距離相對較近。5、設(shè)計(jì)ATP8基因干擾序列并且重組質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶和測序鑒定,表明成功構(gòu)建了pGPH1/GFP/Neo-mouse-shATP8 RNA干擾質(zhì)粒。 結(jié)論:1、本文測得小鼠GV期卵母細(xì)胞的核質(zhì)比為0.054±0.019,與文獻(xiàn)報(bào)道其它物種同時(shí)相核質(zhì)比在相同范圍內(nèi),提示核質(zhì)比是卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的重要指標(biāo);2、線粒體ATP8基因在GV期卵母細(xì)胞中有表達(dá),提示Gv期卵
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