探討CIP2A在骨肉瘤中的表達情況和生物學功能.pdf

1、CIP2A(Cancerous inhibitor of protein phosphatase2A)是蛋白磷酸酶2A(proteinphosphatase2A，PP2A)的癌性抑制因子，又名KIAA1524或p90，是最近被鑒別出的一種人類癌蛋白。多項研究表明CIP2A在正常組織中不表達或低表達而在多種惡性腫瘤中呈高表達，細胞實驗也證實CIP2A與細胞惡性表型及惡性行為密切相關。提示我們CIP2A參與到腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，但是機制尚不

2、清楚。
　　骨肉瘤是一種青少年和兒童的常見惡性腫瘤，約占原發(fā)骨腫瘤的20％，同時占小兒惡性腫瘤的2.4％。骨肉轉(zhuǎn)移的瘤患者的生存率在過去的30年并沒有提高。約有40％的患者因骨肉瘤導致預后不良。因此，研究骨肉瘤的增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制可為骨肉瘤患者治療巨大的好處。越來越多的證據(jù)表明CIP2A是一種能夠促進細胞增殖和細胞侵襲的腫瘤蛋白。然而，CIP2A在骨肉瘤組織中的表達模式以及其對于骨肉瘤細胞侵襲能力的調(diào)控作用尚不明確的。

3、r>　　材料和方法：
　　1、組織來源
　　51例原發(fā)性骨肉瘤病組織，來自于2005年到2012年在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實行手術切除，并經(jīng)病理診斷和分型后的存檔蠟塊，組織經(jīng)10％中性福爾馬林固定、石蠟包埋。蠟塊組織的使用獲得了倫理委員會的同意和許可。所有患者在術前均未接受過放化療。根據(jù)Enneking評分系統(tǒng)，將標本分為高度惡性的局限型骨性肉瘤(ⅡA)，侵襲性骨肉瘤(ⅡB)。
　　2、免疫組織化學染色
　　多

4、克隆抗體CIP2A（1∶200稀釋;Novus生物制劑），采用Elivision試劑盒(MaiXin，China)，以PBS代替一抗作為空白對照。選腫瘤細胞陽性染色集中區(qū)域，每張切片計數(shù)400個癌細胞，由兩名病理醫(yī)師雙盲觀測。結果判定: CIP2A免疫組化陽性信號主要定位于細胞漿，也有少量核表達，表達百分率分為以下4個等級:1-25％為1分，26-50％記為2分，51-75％記為3分，76-100％記為4分。根據(jù)免疫組化染色強度分為3個

5、等級:無著色或僅微弱著色記為0分，淡黃色顆粒著色記為中度1分，棕褐色顆粒強著色記為2分。以陽性細胞率和染色強度的分值乘積作為每一例的積分:＜4為陰性;≥4為陽性。
　　3、細胞培養(yǎng)與siRNA轉(zhuǎn)染
　　MG-63細胞系購自ATCC(Manassas，VA，USA)，用含10％熱滅活新鮮小牛血清MEM(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)、100U/ml的青霉素、100U/ml的鏈霉素(Sigma, St.L

6、ouis，MO，USA)的培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)。
　　CIP2A特異性siRNA和對照亂序siRNA購自Dharmacon(Dharmacon，Lafayette，CO，USA)。siRNA轉(zhuǎn)染試劑為DharmaFECT1(Dharmacon，Lafayette，CO，USA)。60小時后應用Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。
　　4、Western blot檢測
　　收集培養(yǎng)細胞，加入裂解液充

7、分裂解，低溫高速離心(4℃，12000轉(zhuǎn)/min，30min)，提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60ug。電泳（12％SDS-PAGE凝膠）、轉(zhuǎn)印(50V,120min)、5％正常小牛血清封閉，抗CIP2A(1∶1000; Novus), c-Myc，phospho-AKT, AKT(1∶1000, Cell Signaling Technology, USA)和β-actin(1∶1500;BD Bioscience，F(xiàn)ranklin

8、Lakes，NJ，USA)，4℃孵育過夜，分別與對應的二抗(1∶2500，santa cruz，USA)室溫孵育2h，ECL顯色，結果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀(Chemi Imager5500，Alpha Innotech，USA)采集，進行灰度值測定。
　　5、RT-PCR分析
　　轉(zhuǎn)染CIP2A24小時后收集細胞，使用trizols試劑提取RNA，采用ABI highcapacity cDNA RT kit(Applie

9、d Biosystems)進行反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Green PCRmaster mix(Applied Biosystems)進行定量real-time PCR擴增，總體積20μl。使用7900HT實時定量PCR儀過程如下:95℃，30秒;95℃，5秒，40個循環(huán);60℃，30秒。檢測CIP2A和MMP9的表達情況，內(nèi)參采用beta actin。基因相對表達水平計算方式如下△Ct=Ct gene-Ct reference，增加倍數(shù)用

10、如2-△△Ct方法計算，每次試驗均做三個重復孔。 CIP2A forward,5'-ATACTTCAGGACCCACGTTTGAT-3'，CIP2A reverse,5'-TCTCCAAGTACTAAAGCAGGAAAATCT-3'，MMP9 forward,5'-CCTCTGGAGGTTCGACGTGA-3';MMP9 reverse,5'-TAGGCTTTCTCTCGGTACTGGAA-3';β-actin forward,5'-A

11、TAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3'，β-actin reverse,5'-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3'.
　　6、細胞侵襲能力檢測
　　用預冷無血清MEM培養(yǎng)基以1∶5稀釋Matrigel(BD Biosciences，USA)，將轉(zhuǎn)染后24小時后的細胞制成細胞懸液，調(diào)至細胞密度為2.5×10個/ml，取100μl加入上室（孔徑8um，Costar，USA），下室加600μl

12、含10％小牛血清MEM培養(yǎng)基。37℃、5％ CO2孵箱中培養(yǎng)18小時后吸盡培養(yǎng)基，PBS清洗后，甲醇室溫固定15min，用棉簽輕擦掉上表面的細胞，蘇木素染色，室溫干燥過夜。取下微孔膜，至載玻片上，鏡下計數(shù)細胞數(shù)，實驗重復3次，取均值。
　　7、細胞凋亡檢測
　　運用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染試劑盒，收集細胞后經(jīng)冷PSB沖洗后使用結合緩沖液懸浮，并調(diào)整細胞密度值2-5×105/ml，于暗室中在195ul體系中加入5μ

13、lAnnexinⅤ-FITC室溫孵育10分鐘后加入190μl結合緩沖液(1×)和10μl PI。使用FACScan流式細胞儀進行檢測并使用CellQuest分析軟件分析數(shù)據(jù)。
　　8、CKK-8法檢測細胞增殖及集落形成實驗
　　將單個細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200ul含103個細胞，培養(yǎng)24小時，每孔加入CKK-8溶液10ul繼續(xù)培養(yǎng)1小時，振蕩10min，450nm波長下測定各孔光吸收值，以不含細胞的等體積培

14、養(yǎng)基作對照。繪制細胞生長曲線。集落形成實驗在轉(zhuǎn)染48小時后接種1000個細胞于6cm培養(yǎng)皿中2周后用Giemsa染色并計數(shù)。
　　9、數(shù)據(jù)分析
　　采用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件，對CIP2A過表達和MMP9過表達的關系用卡方檢驗;其他實驗結果采用t檢驗進行數(shù)據(jù)分析，用mean±SD表示， P＜0.05為差異有意義。
　　結果：
　　1、CIP2A蛋白在骨肉瘤中的表達隋況
　　我們實用免疫組化方法檢測了正

15、常骨組織和骨肉瘤中CIP2A的表達情況。結果顯示CIP2A的陽性表達主要為細胞漿也有少量核表達。在正常骨組織和軟骨組織中，CIP2A染色呈陰性。而在51例骨肉瘤組織中有39例為CIP2A陽性表達，陽性率為76.5％。接著，我們分析了CIP2A蛋白表達與臨床病理因素之間的關系，發(fā)現(xiàn)CIP2A的表達與年齡、性別、組織學類型和分期沒有明顯關系。雖然我們統(tǒng)計結果顯示CIP2A在晚期骨肉瘤的陽性表達率（ⅡB期骨肉瘤:80.5％）比在早期骨肉瘤（Ⅱ

16、A期:66.6％）陽性表達率更高，但是二者差異無統(tǒng)計學意義。
　　2、干擾CIP2A可以抑制細胞的增殖
　　文獻報道稱CIP2A可以促進腫瘤細胞的增殖能力，但其在骨肉瘤細胞中的生物學功能的研究尚不清楚。為了研究CIP2A對骨肉瘤細胞增殖能力的影響，我們對MG-63細胞進行CIP2A siRNA干擾，48小時后實用MTT和集落形成實驗檢測細胞的增殖能力。Western blot和Real-time PCR結果顯示干擾CIP2A

17、后，MG-63細胞的CIP2A的蛋白和RNA水平均下降。應用集落形成法檢測CIP2A在細胞增殖中的作用，實驗結果顯示與對照組相比，CIP2A缺失的腫瘤細胞其數(shù)量及大小呈顯著降低(control vs sRNAi:336±21 vs167±15，p＜0.05)。此外，CCK-8增殖實驗結果表明抑制CIP2A可以明顯降低細胞的增殖速度。
　　3、CIP2A通過調(diào)節(jié)p-AKT、c-myc的表達影響細胞的增殖
　　最近的研究證明，c

18、-Myc和p-Akt作為CIP2A-PP2A通路的下游靶蛋白也受其調(diào)控。眾所周知，有絲分裂時，c-myc蛋白是一種調(diào)控細胞增殖和分化的調(diào)控蛋白，它可以識別和結合到基因組中特定的調(diào)控序列，激活那些與細胞的增殖和分化有關的基因。為了進一步揭示CIP2A促進細胞增殖的潛在機制，我們在骨肉瘤細胞中進行了CIP2A敲出，western blot結果顯示，抑制CIP2A的表達可以明顯降低c-myc和P-Akt的蛋白水平。上述結果表明CIP2A可能通

19、過調(diào)節(jié)c-myc和Ak而促進惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　4、干擾CIP2A可以促進細胞的凋亡
　　細胞凋亡是重要的細胞程序性死亡形式，腫瘤細胞往往可以逃脫細胞凋亡而達到永生。因此，我們在MG-63細胞系中轉(zhuǎn)染CIP2A特異性siRNA，運用western blot和real-timePCR法在蛋白和RNA水平檢測了干擾效率。運用AnnexinⅤ/PI檢測手段，AnnexinⅤ檢測凋亡細胞而PI檢測死細胞，流式細胞儀檢測結果顯示

20、抑制CIP2A明顯促進腫瘤細胞的凋亡。提示CIP2A促進骨肉瘤細胞的惡性行為。
　　5、干擾CIP2A抑制細胞的侵襲
　　細胞侵襲能力與腫瘤惡性行為密切相關。我們應用Transwell基質(zhì)膠實驗來檢測CIP2A對細胞侵襲性的影響。結果顯示與對照組比較，抑制CIP2A可以顯著抑制細胞的侵襲能力(control vs sRNAi:137±9 vs79±5，p＜0.05)。Real-time PCR結果顯示干擾CIP2A可以抑制基

21、質(zhì)金屬蛋白酶mmp-9的表達。已知mmp-9是重要的侵襲相關因子，能夠降解細胞外基質(zhì)進而促進細胞的侵襲能力。我們的實驗結果與之前CIP2A相關研究報道結果一致，CIP2A作為促癌因子調(diào)節(jié)細胞的增殖，凋亡，侵襲等惡性生物學行為。
　　結論：
　　1、CIP2A在骨肉瘤中存在過表達。
　　2、干擾CIP2A抑制細胞的增殖和侵襲。
　　3、干擾CIP2A促進細胞的凋亡。
　　4、CIP2A調(diào)節(jié)C-MYC/AKT進