2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、CIP2A(Cancerous inhibitor of protein phosphatase2A)是蛋白磷酸酶2A(proteinphosphatase2A,PP2A)的癌性抑制因子,又名KIAA1524或p90,是最近被鑒別出的一種人類癌蛋白。多項(xiàng)研究表明CIP2A在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)而在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá),細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)CIP2A與細(xì)胞惡性表型及惡性行為密切相關(guān)。提示我們CIP2A參與到腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,但是機(jī)制尚不

2、清楚。
  骨肉瘤是一種青少年和兒童的常見惡性腫瘤,約占原發(fā)骨腫瘤的20%,同時(shí)占小兒惡性腫瘤的2.4%。骨肉轉(zhuǎn)移的瘤患者的生存率在過去的30年并沒有提高。約有40%的患者因骨肉瘤導(dǎo)致預(yù)后不良。因此,研究骨肉瘤的增殖,侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制可為骨肉瘤患者治療巨大的好處。越來越多的證據(jù)表明CIP2A是一種能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲的腫瘤蛋白。然而,CIP2A在骨肉瘤組織中的表達(dá)模式以及其對于骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的調(diào)控作用尚不明確的。

3、r>  材料和方法:
  1、組織來源
  51例原發(fā)性骨肉瘤病組織,來自于2005年到2012年在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)行手術(shù)切除,并經(jīng)病理診斷和分型后的存檔蠟塊,組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋。蠟塊組織的使用獲得了倫理委員會的同意和許可。所有患者在術(shù)前均未接受過放化療。根據(jù)Enneking評分系統(tǒng),將標(biāo)本分為高度惡性的局限型骨性肉瘤(ⅡA),侵襲性骨肉瘤(ⅡB)。
  2、免疫組織化學(xué)染色
  多

4、克隆抗體CIP2A(1∶200稀釋;Novus生物制劑),采用Elivision試劑盒(MaiXin,China),以PBS代替一抗作為空白對照。選腫瘤細(xì)胞陽性染色集中區(qū)域,每張切片計(jì)數(shù)400個(gè)癌細(xì)胞,由兩名病理醫(yī)師雙盲觀測。結(jié)果判定: CIP2A免疫組化陽性信號主要定位于細(xì)胞漿,也有少量核表達(dá),表達(dá)百分率分為以下4個(gè)等級:1-25%為1分,26-50%記為2分,51-75%記為3分,76-100%記為4分。根據(jù)免疫組化染色強(qiáng)度分為3個(gè)

5、等級:無著色或僅微弱著色記為0分,淡黃色顆粒著色記為中度1分,棕褐色顆粒強(qiáng)著色記為2分。以陽性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度的分值乘積作為每一例的積分:<4為陰性;≥4為陽性。
  3、細(xì)胞培養(yǎng)與siRNA轉(zhuǎn)染
  MG-63細(xì)胞系購自ATCC(Manassas,VA,USA),用含10%熱滅活新鮮小牛血清MEM(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)、100U/ml的青霉素、100U/ml的鏈霉素(Sigma, St.L

6、ouis,MO,USA)的培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。
  CIP2A特異性siRNA和對照亂序siRNA購自Dharmacon(Dharmacon,Lafayette,CO,USA)。siRNA轉(zhuǎn)染試劑為DharmaFECT1(Dharmacon,Lafayette,CO,USA)。60小時(shí)后應(yīng)用Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。
  4、Western blot檢測
  收集培養(yǎng)細(xì)胞,加入裂解液充

7、分裂解,低溫高速離心(4℃,12000轉(zhuǎn)/min,30min),提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60ug。電泳(12%SDS-PAGE凝膠)、轉(zhuǎn)印(50V,120min)、5%正常小牛血清封閉,抗CIP2A(1∶1000; Novus), c-Myc,phospho-AKT, AKT(1∶1000, Cell Signaling Technology, USA)和β-actin(1∶1500;BD Bioscience,F(xiàn)ranklin

8、Lakes,NJ,USA),4℃孵育過夜,分別與對應(yīng)的二抗(1∶2500,santa cruz,USA)室溫孵育2h,ECL顯色,結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀(Chemi Imager5500,Alpha Innotech,USA)采集,進(jìn)行灰度值測定。
  5、RT-PCR分析
  轉(zhuǎn)染CIP2A24小時(shí)后收集細(xì)胞,使用trizols試劑提取RNA,采用ABI highcapacity cDNA RT kit(Applie

9、d Biosystems)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Green PCRmaster mix(Applied Biosystems)進(jìn)行定量real-time PCR擴(kuò)增,總體積20μl。使用7900HT實(shí)時(shí)定量PCR儀過程如下:95℃,30秒;95℃,5秒,40個(gè)循環(huán);60℃,30秒。檢測CIP2A和MMP9的表達(dá)情況,內(nèi)參采用beta actin?;蛳鄬Ρ磉_(dá)水平計(jì)算方式如下△Ct=Ct gene-Ct reference,增加倍數(shù)用

10、如2-△△Ct方法計(jì)算,每次試驗(yàn)均做三個(gè)重復(fù)孔。 CIP2A forward,5'-ATACTTCAGGACCCACGTTTGAT-3',CIP2A reverse,5'-TCTCCAAGTACTAAAGCAGGAAAATCT-3',MMP9 forward,5'-CCTCTGGAGGTTCGACGTGA-3';MMP9 reverse,5'-TAGGCTTTCTCTCGGTACTGGAA-3';β-actin forward,5'-A

11、TAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3',β-actin reverse,5'-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3'.
  6、細(xì)胞侵襲能力檢測
  用預(yù)冷無血清MEM培養(yǎng)基以1∶5稀釋Matrigel(BD Biosciences,USA),將轉(zhuǎn)染后24小時(shí)后的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,調(diào)至細(xì)胞密度為2.5×10個(gè)/ml,取100μl加入上室(孔徑8um,Costar,USA),下室加600μl

12、含10%小牛血清MEM培養(yǎng)基。37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)18小時(shí)后吸盡培養(yǎng)基,PBS清洗后,甲醇室溫固定15min,用棉簽輕擦掉上表面的細(xì)胞,蘇木素染色,室溫干燥過夜。取下微孔膜,至載玻片上,鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。
  7、細(xì)胞凋亡檢測
  運(yùn)用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染試劑盒,收集細(xì)胞后經(jīng)冷PSB沖洗后使用結(jié)合緩沖液懸浮,并調(diào)整細(xì)胞密度值2-5×105/ml,于暗室中在195ul體系中加入5μ

13、lAnnexinⅤ-FITC室溫孵育10分鐘后加入190μl結(jié)合緩沖液(1×)和10μl PI。使用FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測并使用CellQuest分析軟件分析數(shù)據(jù)。
  8、CKK-8法檢測細(xì)胞增殖及集落形成實(shí)驗(yàn)
  將單個(gè)細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔體積200ul含103個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24小時(shí),每孔加入CKK-8溶液10ul繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí),振蕩10min,450nm波長下測定各孔光吸收值,以不含細(xì)胞的等體積培

14、養(yǎng)基作對照。繪制細(xì)胞生長曲線。集落形成實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后接種1000個(gè)細(xì)胞于6cm培養(yǎng)皿中2周后用Giemsa染色并計(jì)數(shù)。
  9、數(shù)據(jù)分析
  采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,對CIP2A過表達(dá)和MMP9過表達(dá)的關(guān)系用卡方檢驗(yàn);其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,用mean±SD表示, P<0.05為差異有意義。
  結(jié)果:
  1、CIP2A蛋白在骨肉瘤中的表達(dá)隋況
  我們實(shí)用免疫組化方法檢測了正

15、常骨組織和骨肉瘤中CIP2A的表達(dá)情況。結(jié)果顯示CIP2A的陽性表達(dá)主要為細(xì)胞漿也有少量核表達(dá)。在正常骨組織和軟骨組織中,CIP2A染色呈陰性。而在51例骨肉瘤組織中有39例為CIP2A陽性表達(dá),陽性率為76.5%。接著,我們分析了CIP2A蛋白表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)CIP2A的表達(dá)與年齡、性別、組織學(xué)類型和分期沒有明顯關(guān)系。雖然我們統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示CIP2A在晚期骨肉瘤的陽性表達(dá)率(ⅡB期骨肉瘤:80.5%)比在早期骨肉瘤(Ⅱ

16、A期:66.6%)陽性表達(dá)率更高,但是二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  2、干擾CIP2A可以抑制細(xì)胞的增殖
  文獻(xiàn)報(bào)道稱CIP2A可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖能力,但其在骨肉瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能的研究尚不清楚。為了研究CIP2A對骨肉瘤細(xì)胞增殖能力的影響,我們對MG-63細(xì)胞進(jìn)行CIP2A siRNA干擾,48小時(shí)后實(shí)用MTT和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖能力。Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示干擾CIP2A

17、后,MG-63細(xì)胞的CIP2A的蛋白和RNA水平均下降。應(yīng)用集落形成法檢測CIP2A在細(xì)胞增殖中的作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對照組相比,CIP2A缺失的腫瘤細(xì)胞其數(shù)量及大小呈顯著降低(control vs sRNAi:336±21 vs167±15,p<0.05)。此外,CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制CIP2A可以明顯降低細(xì)胞的增殖速度。
  3、CIP2A通過調(diào)節(jié)p-AKT、c-myc的表達(dá)影響細(xì)胞的增殖
  最近的研究證明,c

18、-Myc和p-Akt作為CIP2A-PP2A通路的下游靶蛋白也受其調(diào)控。眾所周知,有絲分裂時(shí),c-myc蛋白是一種調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控蛋白,它可以識別和結(jié)合到基因組中特定的調(diào)控序列,激活那些與細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)的基因。為了進(jìn)一步揭示CIP2A促進(jìn)細(xì)胞增殖的潛在機(jī)制,我們在骨肉瘤細(xì)胞中進(jìn)行了CIP2A敲出,western blot結(jié)果顯示,抑制CIP2A的表達(dá)可以明顯降低c-myc和P-Akt的蛋白水平。上述結(jié)果表明CIP2A可能通

19、過調(diào)節(jié)c-myc和Ak而促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
  4、干擾CIP2A可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡
  細(xì)胞凋亡是重要的細(xì)胞程序性死亡形式,腫瘤細(xì)胞往往可以逃脫細(xì)胞凋亡而達(dá)到永生。因此,我們在MG-63細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染CIP2A特異性siRNA,運(yùn)用western blot和real-timePCR法在蛋白和RNA水平檢測了干擾效率。運(yùn)用AnnexinⅤ/PI檢測手段,AnnexinⅤ檢測凋亡細(xì)胞而PI檢測死細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示

20、抑制CIP2A明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。提示CIP2A促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的惡性行為。
  5、干擾CIP2A抑制細(xì)胞的侵襲
  細(xì)胞侵襲能力與腫瘤惡性行為密切相關(guān)。我們應(yīng)用Transwell基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)來檢測CIP2A對細(xì)胞侵襲性的影響。結(jié)果顯示與對照組比較,抑制CIP2A可以顯著抑制細(xì)胞的侵襲能力(control vs sRNAi:137±9 vs79±5,p<0.05)。Real-time PCR結(jié)果顯示干擾CIP2A可以抑制基

21、質(zhì)金屬蛋白酶mmp-9的表達(dá)。已知mmp-9是重要的侵襲相關(guān)因子,能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲能力。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前CIP2A相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果一致,CIP2A作為促癌因子調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖,凋亡,侵襲等惡性生物學(xué)行為。
  結(jié)論:
  1、CIP2A在骨肉瘤中存在過表達(dá)。
  2、干擾CIP2A抑制細(xì)胞的增殖和侵襲。
  3、干擾CIP2A促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。
  4、CIP2A調(diào)節(jié)C-MYC/AKT進(jìn)

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