14-3-3ε和αN-catenin組織特異性表達及二者之間相互作用的研究.pdf

1、目的：14-3-3蛋白是一類在真核生物中廣泛表達，氨基酸序列高度保守的蛋白家族。近年來研究發(fā)現(xiàn)該類蛋白質可以與眾多的原癌基因產(chǎn)物和信號分子以及細胞骨架蛋白相結合，從而在細胞信號傳導、細胞周期調控、細胞凋亡、基因表達調控等方面起重要的作用。 連環(huán)蛋白(catenin)是一類起細胞黏附和信號轉導作用的細胞內(nèi)糖蛋白家族。我室以往應用酵母雙雜交技術篩選發(fā)現(xiàn)14-3-3<,ε>與αN-catenin有較強的相互作用。本研究在確定這兩種蛋白

2、組織分布的基礎上，用原核表達系統(tǒng)表達GST-14-3-3<,ε>融合蛋白，經(jīng)GST 蛋白沉降技術(GSTpull-down assay)，進一步驗證14-3-3<,ε>與αN-catenin之間的相互作用，為探討14-3-3<,ε>和aN-catenin表達及其相互作用在血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)表型轉化和細胞骨架重構中的意義奠定基礎。 方法： 1、14-3-3<,

3、ε>和αN-catenin在大鼠不同組織中的表達活性1．1 14-3-3<,ε>和αN-catenin mRNA檢測用Trizol一步法提取大鼠血管、腦、肺、心、肝、腎、睪丸、腸、脾共9種組織的總RaNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，測定OD260吸收確定其含量后，進行RT-PCR。 1．2 14-3-3<,ε>和αN-catenin蛋白水平分析提取大鼠血管、腦、肺、心、肝、腎、睪丸、腸、脾共9種組織的總蛋白后進行Western b

4、lot分析。 2、14-3-3<,ε>原核表達質粒的構建與鑒定將經(jīng)RT-PCR獲取的14-3-3<,ε>全長cDNA，經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切后，定向克隆到pGEX-4T-1載體中，重組質粒經(jīng)酶切和測序鑒定正確無誤后，命名為pGEX-4T-1-14-3-3<,ε>。 3、GST-14-3-3<,ε>融合蛋白的誘導表達及純化將pGEX-4T-1-14-3-3<,ε>質粒轉化Ecoli BL21工程菌，對IPTG濃度

5、、誘導時間等條件進行優(yōu)化。在最佳條件下誘導轉化菌表達外源蛋白后，收集菌體，超聲裂菌后收集上清，用GST-Sepharose 4B親和層析對GST-14-3-3<,ε>融合蛋白進行純化。 4、GST pull-down研究14-3-3<,ε>和αN-catenin之間的相互作用將大鼠血管蛋白提取液與結合有GST-14-3-3<,ε>融合蛋白的GST-Sepharose 4B球珠共同孵育后，取沉淀進行SDS-PAGE及Western

6、 blot分析。 結果： 1、14-3-3<,ε>和αN-catenin基因在大鼠不同組織中的表達活性RT-PCR 結果顯示，在轉錄水平上，14-3-3<,ε>在所檢測的9種組織中都有表達，且在血管、肺、腎、睪丸、腸中表達量較高。αN-catenin在各組織中的表達豐度明顯低于14-3-3<,ε>，且在腎臟中不可檢出。二者在血管均有較高表達。 Western blot分析結果顯示，蛋白水平上，在所檢測的組織中均有14-3

7、-3<,ε>的表達，αN-catenin在血管、腦、睪丸、腸、脾中表達較高。 2、pGEX-4T-1-14-3-3<,ε>原核表達質粒的構建酶切鑒定和測序結果顯示，重組質粒pGEX-4T-1-14-3-3<,ε>中插入的14-3-3<,ε> cDNA長度正確，核苷酸序列無誤。 3、GST-14-3-3<,ε>融合蛋白的誘導表達轉化pGEX-4T-1-14-3-3<,ε>的宿主菌經(jīng)IPTG誘導后，可表達分子量為54 kD的

8、蛋白質，與預期大小一致。 4、GST-14-3-3<,ε>融合蛋白的分離純化轉化菌裂解液經(jīng)GST-Sepharose 4B親和層析純化后，SDS-PAGE可見分子量為54 kD的單一條帶。 5、14-3-3<,ε>與αN-catenin之間存在物理學上的相互作用GST pull-down分析結果顯示，aN-catenin可與GST-14-3-3<,ε>蛋白結合，但不能與GST蛋白相結合。表明14-3-3<,ε>與αN-c

9、atenin可直接進行相互作用。 結論： 1、確立了14-3-3<,ε>和αN-catenin基因在大鼠不同組織中的表達活性。 2、成功構建了14-3-3<,ε>原核表達質粒pGEX-4T-1-14-3-3<,ε>。 3、對GST-14-3-3<,ε>融合蛋白在大腸桿菌中的表達條件進行了優(yōu)化。 4、經(jīng)過對原核表達產(chǎn)物進行GST親和層析得到電泳純的GST-14-3-3<,ε>融合蛋白。 5、