β3-腎上腺素能受體調(diào)控NOS偶聯(lián)在壓力負(fù)荷小鼠心肌肥厚中的作用.pdf

1、研究背景：心肌肥厚是心臟對多種病理性刺激，如高血壓，缺血性心臟病，瓣膜缺陷等引起壓力負(fù)荷升高的一種代償性反應(yīng)。這種反應(yīng)早期通過增加心臟收縮力有利于維持心功能。然而，持續(xù)的壓力負(fù)荷，導(dǎo)致體內(nèi)多種神經(jīng)體液因子激活，這些神經(jīng)體液因子最終會導(dǎo)致心肌損傷，心功能惡化，促進心臟衰竭的發(fā)生發(fā)展，嚴(yán)重威脅人類健康。然而心肌肥厚的發(fā)病機制目前尚不十分明確，并缺乏有效的治療措施。因此，探索心肌肥厚的發(fā)生機制及其防治措施是心血管領(lǐng)域研究的熱點問題。β腎上腺素

2、能受體（β-AR）家族在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)除了傳統(tǒng)的β1/β2-AR之外，心臟還存在β3-AR。與β1/β2-AR相反，β3-AR的激活抑制心肌收縮力。已經(jīng)在人體和動物模型中證實，心衰時β3-AR表達(dá)增加。然而β3-AR的增加在心衰中到底扮演了何種角色，是對兒茶酚胺濃度過高的代償性保護反應(yīng)還是心衰的促進因子目前尚不清楚。
　　最新研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮合酶（NOS）解耦聯(lián)是導(dǎo)致NO水平下降和活性氧（ROS

3、）水平升高的重要機制，是高血壓、糖尿病、胰島素抵抗、肥胖、動脈粥樣硬化、心力衰竭等疾病中發(fā)生的重要原因，糾正NOS解耦聯(lián)有望為保護心血管系統(tǒng)提供有效途徑。NOS解耦聯(lián)是否參與了β3-AR對心臟的調(diào)控作用，目前尚未見報道。
　　研究目的：本研究通過觀察β3-AR基因敲除小鼠（β3-/-）壓力負(fù)荷下心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化，以及壓力負(fù)荷時給予野生型（WT）小鼠β3-AR激動劑治療后心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化，從正反兩方面研究β3-AR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通

4、路對壓力負(fù)荷時心臟的調(diào)控作用，探討NOS解耦聯(lián)在β3-AR調(diào)節(jié)心臟功能中的作用，旨在闡明β3-AR通過調(diào)控NOS偶聯(lián)發(fā)揮心臟保護作用，為心肌肥厚，心力衰竭的防治提供新的理論依據(jù)和治療措施。
　　研究方法：本研究通過結(jié)扎小鼠主動脈弓建立壓力負(fù)荷心肌肥厚模型，采用心臟超聲、組織學(xué)方法及多種分子生物學(xué)技術(shù)，（1）比較β3-AR基因敲除小鼠和野生型小鼠給予慢性壓力負(fù)荷后，心臟結(jié)構(gòu)和功能、NOS活性及蛋白表達(dá)，活性氧及BH4水平的變化。（2

5、）觀察給予β3-AR基因敲除小鼠BH4補充性治療，對壓力負(fù)荷所致心肌肥厚，心功能和活性氧的改變。（3）觀察給予壓力負(fù)荷野生型小鼠β3-AR激動劑BRL37344治療，心臟結(jié)構(gòu)和功能，NOS活性及蛋白表達(dá)，活性氧水平的變化。
　　研究結(jié)果：（1）8周大FVBβ3-/-小鼠體重，室壁厚度及超聲測算的左室重量較FVBWT小鼠輕度增加，而心率，左室腔內(nèi)徑及收縮功能兩組間沒有統(tǒng)計學(xué)差別。14-18月時WT小鼠表現(xiàn)為輕度心肌肥厚（P<0.05

6、vs.8周），而β3-/-小鼠則有明顯的左室肥厚，其室壁厚度（1.30±0.14vs.0.86±0.07mm,P<0.001）和左室重量（196±12vs.129±20mg,P<0.05）均較WT小鼠顯著增加。（2）分別給予β3-/-和WT小鼠輕度主動脈縮窄術(shù)（25GTAC）和假手術(shù)（sham）后，β3-/-小鼠TAC9周后存活率較WT小鼠明顯下降（38％vs.85％,χ2=10.78,P<0.001）。（3）TAC9周后，β3-/-小

7、鼠較WT小鼠發(fā)生更為嚴(yán)重的心肌肥厚和心臟重構(gòu)，表現(xiàn)為進一步增加的心臟重量/脛骨長度比值（HW/TL175.2±17.8vs.123.3±4.0,P<0.01），心肌細(xì)胞直徑（39.3±0.9vs.31.3±0.9μm,P<0.001）和心肌纖維化程度（2.7±0.3vs.1.2±0.1,P<0.05vs.WT/TACforall）。（4）心臟超聲結(jié)果顯示W(wǎng)T小鼠TAC后，LVEDD,LVESD和小軸縮短率與假手術(shù)組比較無明顯變化，而β3

8、-/-小鼠TAC后，LVEDD（3.90±0.26vs.2.91±0.04mm,P<0.001）和LVESD（2.47±0.36vs.1.02±0.05mm,P<0.001）較假手術(shù)組明顯增加，小軸縮短率顯著降低（38.2±5.0vs.64.9±1.8％,P<0.001）。（5）WT小鼠和β3-/-小鼠TAC后，室壁厚度（1.30±0.02vs.0.83±0.01mm,P<0.001）明顯增加，但β3-/-小鼠較WT小鼠的室壁厚度（1.

9、43±0.03vs.1.02±0.03mm,P<0.001vs.β3-/-/sham;P<0.01vs.WT/TAC）增加更多。（6）基礎(chǔ)狀態(tài)下β3-/-和WT小鼠心臟NOS活性無區(qū)別（26.9±0.4vs.27.6±0.4A.U.,P=NS）。TAC9周后，WT小鼠NOS活性較sham組無明顯變化（27.7±0.3A.U.,P=NSvs.WT/sham），而β3-/-小鼠心臟NOS活性較β3-/-/sham組明顯下降（19.3±1.2

10、A.U.,P<0.001vs.β3-/-/sham）。（7）基礎(chǔ)狀態(tài)下，β3-/-和WT小鼠心臟超氧化物活性無差別（1145±146vs.1106±109cpm/mg，P=NS）。TAC9周后，WT和β3-/-小鼠心臟總O2-活性均較sham組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但β3-/-小鼠O2-活性較WT小鼠升高近60％（2730±121vs.1719±52cpm/mg，P<0.05vs.sham,P<0.001vs.WT/TAC）。（8）基

11、礎(chǔ)狀態(tài)下β3-/-和WT小鼠心臟NOS依賴的O2-活性無差別（P=NS）。TAC9周后，WT小鼠NOS依賴的O2-活性較sham組增加不到1倍，而β3-/-小鼠TAC9周后NOS依賴的O2-活性較sham組升高2倍多，并且較WT/TAC小鼠進一步增加（P<0.01,β3-/-/TACvs.WT/TAC）。（9）基礎(chǔ)狀態(tài)下β3-/-和WT小鼠心臟GTPCH-1的蛋白表達(dá)水平無區(qū)別。TAC9周后，WT小鼠較sham組心臟GTPCH-1的蛋白

12、表達(dá)水平無明顯變化。而β3-/-小鼠TAC9周后心肌GTPCH-1的蛋白表達(dá)量較sham組明顯下降（P<0.05vs.β3-/-/sham）。（10）各組間心肌組織BH4含量無明顯變化，β3-/-小鼠TAC后BH4含量略有增高（35.6±1.9vs.27.0±0.9pmol/mgprotein，P<0.01）。而基礎(chǔ)狀態(tài)下β3-/-小鼠BH4/（BH2+生物嘌呤）比值較WT小鼠下降了25％（1.49±0.2vs.1.91±0.3，P<0

13、.05），TAC后沒有進一步下降。（11）給予FVBβ3-/-/TAC小鼠BH4補充性治療后，治療組小鼠心肌收縮力較安慰劑組明顯提高（-0.4±0.2vs.-16.1±4.9％,P<0.05vs.β3-/-/TAC），左室重量較安慰劑組顯著降低（+15.0±6.8vs.+81.8±13.7％,P<0.01vs.β3-/-/TAC）。（12）β3-/-/TACBH4治療組小鼠心肌NOS來源的O2-活性較安慰劑治療組顯著下降（P<0.05v

14、s.β3-/-/TAC+vehicle;P=NSvs.β3-/-/shamandWT/sham）。（13）C57BL/6WT小鼠經(jīng)27GTAC手術(shù)3周后心腔擴大，心肌收縮力下降。與sham組小鼠比較LVEDD增加82％（2.00±0.20vs.1.10±0.03mm;P<0.001），小軸縮短率降低36％（39.1±4.5vs.61.4±0.3％；P<0.001）。左室重量（172±13vs.76±5mg;P<0.001）和室壁厚度（1

15、.21±0.04vs.0.84±0.02mm;P<0.001）也較sham組小鼠增加。而通過皮下植入微量泵給予0.1mg/kg/dayBRL治療完全防止了壓力負(fù)荷所致的心腔擴大（LVESD1.32±0.06mm;P=NSvs.sham,P<0.01vs.TAC）和心功能下降（FS％57.8±1.4％;P=NSvs.sham,P<0.001vs.TAC）。BRL治療組小鼠左室重量和室壁厚度也較安慰劑組明顯下降（P<0.001vs.TAC）

16、。（14）BRL治療組小鼠與安慰劑組比較心肌肥厚的程度明顯減輕（HW/TL100±4vs.122±8mg/cm;P<0.05），心肌細(xì)胞直徑較安慰劑組明顯降低（13.31±0.21vs.15.81±0.35μm,P<0.001）。然而BRL治療對心肌纖維化無明顯改善（1.50±0.35vs.1.67±0.33,P=NS)。（15）硝酸還原酶法測定的心肌NO終末產(chǎn)物硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度在TAC3周后較shan組小鼠降低50％（5.03±0

17、.52vs.10.10±1.99μM,P<0.05）。BRL治療組小鼠心肌NO活性恢復(fù)正常水平（13.73±1.84μM,P<0.01vs.TAC;P=NSvs.sham）。（16）WT小鼠27GTAC3周后心肌總O2-活性較對照組增加約2.5倍（21459±782.8vs.6099±1703CPM/mg;P<0.001），BRL治療組小鼠心肌總O2-活性較安慰劑治療組明顯下降（14017±838.2CPM/mg;P<0.01）。更為重

18、要的是，BRL對心肌超氧陰離子的抑制作用在nNOS特異性地拮抗劑L-VNIO的作用下完全消失（21992±75.68vs.21063±2930CPM/mg;P=NSvs.TAC）。（17）TAC后，eNOS單體/二聚體比值顯著增加（m/d1.10±0.24vs.0.45±0.05;P<0.05），eNOS二聚體解離，然而BRL治療并沒有降低eNOS單體/二聚體比值（1.01±0.02;P=NSvs.TAC。（18）BRL對eNOS總蛋白

19、表達(dá)量沒有明顯改變。但BRL治療組小鼠心肌p-eNOSSer1177/eNOS比值較安慰劑治療組明顯降低（0.92±0.01vs.1.40±0.02;P<0.01）。而p-eNOSSer114/eNOS比值則較安慰劑治療組增加了1倍（4.64±0.60vs.2.33±0.22;P<0.05）。p-eNOSThr495/eNOS比值在各組間也無明顯變化。（19）壓力負(fù)荷3周后小鼠心肌nNOS表達(dá)無明顯變化，而BRL治療組小鼠心肌nNOS蛋

20、白表達(dá)量是安慰劑治療組的3倍（1.11±0.22vs.0.39±0.17;P<0.05vs.TAC）。iNOS蛋白表達(dá)在TAC后略有增加，但BRL對iNOS蛋白表達(dá)無影響（0.34±0.09;P=NSvs.TAC）。
　　研究結(jié)論：（1）老年和輕度壓力負(fù)荷后β3-/-較野生型小鼠發(fā)生了更為嚴(yán)重的心肌肥厚，心肌纖維化，心室腔擴大和心功能下降。（2）壓力負(fù)荷時β3-AR基因敲除小鼠心肌發(fā)生NOS解耦聯(lián)，NOS生成NO的水平下降，而生成

21、活性氧水平增加。（3）壓力負(fù)荷時β3-AR基因敲除小鼠心肌組織GTPCH-1的蛋白表達(dá)量和BH4/（BH2+生物嘌呤）的比值下降可能是NOS解耦聯(lián)的原因。外源性補充BH4治療明顯改善了壓力負(fù)荷所致的心臟功能下降和左室肥厚。（4）給予野生型小鼠選擇性β3-AR激動劑BRL治療3周完全預(yù)防了壓力負(fù)荷所致的心腔擴大，心臟功能下降，并部分地抑制了心肌肥厚的發(fā)展。（5）β3-AR激動劑治療后心肌NO活性恢復(fù)正常，ROS活性降低，且BRL對ROS活