β3腎上腺素能受體與膀胱過度活動癥關(guān)系的研究.pdf

1、目的
　　 目前關(guān)于膀胱過度活動癥(OAB)發(fā)病機制的研究主要集中在逼尿肌受體的異常,已證實β腎上腺素能受體(β-AR)能夠介導(dǎo)膀胱平滑肌松弛,對維持儲尿過程中膀胱良好的順應(yīng)性起著關(guān)鍵作用,闡明β-AR三種亞型與逼尿肌松弛的關(guān)系及起主要作用的β3-AR基因突變與OAB的關(guān)系具有重要意義。通過RNAi技術(shù),封閉β腎上腺素能受體亞型中的兩個,獲得表達單一β-AR亞型的逼尿肌細胞,借助異丙腎上腺(ISO)激活各單一亞型逼尿肌細胞,檢測

2、胞內(nèi)cAMP表達水平,以確定松弛膀胱逼尿肌的主要β腎上腺素能受體亞型。通過對比分析OAB病例與正常對照組之間β3-AR的Trp64ArgSNP的基因突變率和基因型,以及存在此突變的β3-AROAB病例與其他對照組在不同濃度ISO激活下cAMP表達水平的比較,明確此β3-AR基因突變是OAB發(fā)生及治療耐藥的一個原因。
　　 方法
　　 1.研究對象
　　 293FT細胞購自Invitrogen公司;DMEM培養(yǎng)基;

3、100mg/L氨芐青霉素、50mg/L鏈霉素;10%胎牛血清(四季青公司);PBS(磷酸鹽緩沖溶液);胰酶/EDTA消化液;Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑;β1-PGS質(zhì)粒、β2-PGS質(zhì)粒和β3-PGS質(zhì)粒。選取臨床尿動力學(xué)檢測證實為逼尿肌不穩(wěn)定病例20名(存在膀胱充盈期出現(xiàn)大于15cmH2O的逼尿肌期相性收縮)和10名正常對照,內(nèi)切酶采用限制性內(nèi)切酶BstNI(酶切位點CC↓(A/T)GC)。
　　 2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染逼尿肌

4、細胞
　　 采用293FT細胞系傳代培養(yǎng),構(gòu)建各受體亞型轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體,在1mL無血清DMEM中分別稀釋β1-PGS質(zhì)粒和β2-PGS質(zhì)粒;旋轉(zhuǎn)1秒鐘,再加入β1-PGS質(zhì)粒和β2-PGS質(zhì)?！|(zhì)體懸液,旋轉(zhuǎn);室溫下放置10分鐘,使β1-PGS質(zhì)粒和β2-PGS質(zhì)粒結(jié)合在脂質(zhì)體上。在裝有培養(yǎng)的逼尿肌細胞每孔中加入含20%FCS的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)24小時,吸出DMEM-β1-PGS質(zhì)粒和β2-PGS質(zhì)?！|(zhì)體混合物加入新鮮1

5、0%FCS的DMEM,2ml/孔,再培養(yǎng)48小時。用消化法收集細胞。
　　 3.正常傳代逼尿肌細胞與轉(zhuǎn)染后細胞的β-AR受體表達RT-PCR法鑒定
　　 首先提取正常傳代逼尿肌細胞與轉(zhuǎn)染后細胞中總RNA,然后根據(jù)Genebank提供的三種β-AR基因序列(NM_000024)采用Olig06.6軟件設(shè)計引物,擴增目的基因。
　　 引物序列如下:
　　 β1-AR
　　 正義引物:5'-CGGGCA

6、ATGTGCTGGTGA-3'
　　 反義引物:3'-GGAAGGCGATGGTCTCGGAC-5'
　　 反應(yīng)產(chǎn)物長度:287bp
　　 β2-AR
　　 正義引物:5'-GAGCCTGCTGACCAAGA-3'
　　 反義引物:3'CAATCCGTAGTAGTACCC-5'
　　 反應(yīng)產(chǎn)物長度:414bp
　　 β3-AR
　　 正義引物:5'-GCCTTCGCCTCC

7、AACAT-3'
　　 反義引物:3'-TCCAATACGGTTAAGACGG-5'
　　 反應(yīng)產(chǎn)物長度:415bp
　　 beta-actin序列如下:
　　 正義引物:5'-TAGTTGCGTTACACCCTTTC-3'
　　 反義引物:3'-CCTTGCCACTTCCACTGT-5'
　　 反應(yīng)產(chǎn)物長度:187bp
　　 RT-PCR擴增β-AR全長cDNA,自動電泳凝膠成像

8、分析儀分析結(jié)果。
　　 4.正常傳代逼尿肌細胞與轉(zhuǎn)染后細胞的β-AR受體表達免疫蛋白印跡雜交法鑒定
　　 將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液收集在15ml離心管中,用細胞刮子刮除生長在皿底的細胞,在室溫條件下用PBS沖洗后也收集在同一離心管中。進行SDS-PAGE電泳,將電泳后的膠取出浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中,將凝膠貼于PVDF膜上,雜交后進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),將膠片放入自動電泳凝膠成像分析儀進行數(shù)據(jù)分析。
　　 5.異丙腎上腺素對β腎上腺

9、素能受體單一亞型細胞克隆cAMP水平的影響
　　 將原代培養(yǎng)的膀胱逼尿肌細胞,空載體轉(zhuǎn)染的逼尿肌細胞和經(jīng)過鑒定的β腎上腺素能受體單一基因亞型細胞克隆分別加入100μl異丙腎上腺素(4個濃度組一10-7、10-8、10-9、10-10mol/L),用超聲細胞破碎儀破碎細胞(30s×5次),12000r/mIn4℃離心10min,然后分別吸取上清液留用。cAMP的測定按cAMP放射免疫試劑盒說明書進行。
　　 6.對比分析O

10、AB與對照組β3-AR的Trp64ArgSNP基因型及突變率
　　 用DNA提取試劑盒提取DNA,進行PCR。
　　 引物一:CGCCCAATACCGCCAACAC
　　 引物二:CCACCAGGAGTCCCATCACC
　　 酶切反應(yīng)體系:PCR產(chǎn)物10微升;0.5微升BstN1;2微升10乘Buffer;100乘BSA0.2微升;水7.3微升;條件:60度水浴消化3個小時。2%瓊脂糖凝膠電泳,條件為8

11、0V,60～90分鐘,至溴酚藍前沿走至膠底部。自動電泳凝膠成像分析儀分析結(jié)果。
　　 7.對比分析β3-AR的Trp64A瑪SNP與其引起的cAMP表達水平的關(guān)系
　　 將經(jīng)過鑒定僅表達β3腎上腺素能受體亞型的細胞克隆按OAB組存在β3-AR的Trp64ArgSNP、OAB組野生型β3-AR和對照組野生型β3-AR分別加入100μl異丙腎上腺素(4個濃度組-10-7、10-8、10-9、10-10mol/L),用超聲細胞

12、破碎儀破碎細胞(30s×5次),12000r/mIn4℃離心10min,然后分別吸取上清液留用。cAMP的測定按cAMP放射免疫試劑盒說明書進行。
　　 結(jié)果
　　 1.RT-PCR鑒定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染逼尿肌細胞結(jié)果
　　 電泳結(jié)果顯示:與空載體轉(zhuǎn)染的逼尿肌及未被轉(zhuǎn)染的正常傳代的逼尿肌細胞相比,β1-AR、β2-AR和β3-AR干涉分子轉(zhuǎn)染逼尿肌細胞中β1-AR、β2-AR和β2-AR mRNA表達顯著減少,β-act

13、in mRNA表達無顯著差異,說明RNAi對β1-AR、β2-AR和β3-ARmRNA表達抑制是特異性的。光密度掃描結(jié)果顯示pGC-β1-Ari轉(zhuǎn)染細胞與未轉(zhuǎn)染細胞相比β1-AR mRNA表達抑制率可達74%,pGC-β2-Ari轉(zhuǎn)染細胞與未轉(zhuǎn)染細胞相比β2-AR mRNA表達抑制率可達81%,pGC-β3-ARi轉(zhuǎn)染細胞與未轉(zhuǎn)染細胞相比β3-AR mRNA表達抑制率可達77%。
　　 2.蛋白印記雜交鑒定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染逼尿肌細胞的

14、結(jié)果
　　 通過Western蛋白印跡檢測了β-AR蛋白表達的變化,蛋白電泳結(jié)果顯示:與空載體轉(zhuǎn)染的逼尿肌及未被轉(zhuǎn)染的正常傳代的逼尿肌細胞相比,β1-AR、β2-AR和β3-AR干涉分子轉(zhuǎn)染的細胞中蛋白表達水平顯著下降,而β-actin蛋白表達無顯著差異,說明RNAi抑制β-AR蛋白的表達是特異性的。光密度掃描結(jié)果顯示pGC-β1-Ari、pGC-β2-Ari和pGC-β3-Ari的抑制率分別為81%、87%和85%。
　

15、　 3.各β-AR亞型逼尿肌細胞在不同ISO濃度下cAMP表達水平的比較結(jié)果。
　　 細胞內(nèi)cAMP水平在異丙腎上腺素(10-10～10-7mol/L)作用下呈劑量依賴性升高,當(dāng)異丙腎上腺素(ISO)濃度超過10-8mol/L時,可見明顯升高cAMP的效應(yīng),其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(X2=3.99,p=0.042),最大作用見于10-7mol/L。Β1、β2、β3三種基因亞型的逼尿肌細胞產(chǎn)生了不同的cAMP水平,而且在ISO各個濃度

16、(10-7、10-8、10-9、10-10mol/L)β3-AR亞型的逼尿肌細胞產(chǎn)生的cAMP水平最高(X2=6.34,p=0.012)。
　　 4.OAB與對照組β3-AR的Trp64ArgSNP基因型及突變率
　　 OAB組20名病例發(fā)生β3-AR的Trp64ArgSNP病例為13名,突變率65%,其中突變純合子9名,突變率45%;雜合子4名,突變率20%。對照組10名病例發(fā)生β3-AR的Trp64ArgSNP病例2

17、名,突變率20%,皆為雜合子。兩組突變率差異有顯著性差異(X2=5.41,p=0.02)。
　　 5.β3-AR的Trp64ArgSNP與其引起的cAMP表達水平的關(guān)系
　　 細胞內(nèi)cAMP水平在異丙腎上腺素(10-10～10-7mol/L)作用下仍然呈劑量依賴性升高,當(dāng)異丙腎上腺素(ISO)濃度超過10-8mol/L時,OAB組與對照組中野生型β3-AR病例可見明顯升高cAMP的效應(yīng),其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(X2=4.73

18、,p=0.030),而OAB組中Trp64ArgSNP的β3-AR病例升高效應(yīng)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(X2=2.12,p=0.146),ISO最大作用見于10-7mol/L。
　　 對比分析在ISO各個濃度(10-7、10-8、10-9、10-10mol/L)下,OAB組Trp64ArgSNP的β3-AR逼尿肌細胞,野生型β3-AR逼尿肌細胞,以及對照組野生型β3-AR逼尿肌細胞的三種細胞產(chǎn)生的cAMP水平,結(jié)果表明對照組野生型β3-

19、AR逼尿肌細胞產(chǎn)生的cAMP水平最高,OAB組Trp64ArgSNP的β3-AR胱逼尿肌細胞產(chǎn)生的cAMP水平最低,依據(jù)不同濃度繪制的三組cAMP表達水平曲線相比差異有顯著性意義。(X2=13.48,P=0.001)
　　 結(jié)論
　　 1.借助RT-PCR與免疫蛋白電泳技術(shù)證實RNAi對β1-AR、β2-AR和β3-ARmRNA表達抑制是特異性的。
　　 2.cAMP表達水平呈異丙腎上腺素劑量依賴性上升,對比證實

20、β3-AR在介導(dǎo)逼尿肌松弛過程中起著更為主要的作用,而其它兩種亞型則起著從屬作用。
　　 3.OAB組病例β3-AR的Trp64ArgSNP突變率明顯增高,不同ISO濃度下,OAB病例組Trp64ArgSNP的β3-AR和野生型β3-AR逼尿肌細胞表達的cAMP水平均低于對照組野生型β3-AR逼尿肌細胞,OAB病例β3-AR松弛逼尿肌功能障礙與該受體亞型Trp64ArgSNP有關(guān)。
　　 4.OAB病例組Trp64Arg