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1、背景與目的:基因組印記(Genomic Imprinting)是指由于表遺傳學(xué)水平的修飾特意地沉默某一親代來源的等位基因,具有這種特征的基因稱為印記基因。人胰島素樣生長(zhǎng)因子2(Insulin-like growth factor 2, IGF2)和H19即為研究較早的一對(duì)相互毗鄰的印記基因。IGF2編碼的胰島素樣生長(zhǎng)因子-2是一種胚胎生長(zhǎng)因子及細(xì)胞有絲分裂原,在人體內(nèi)大多數(shù)組織中特異地表達(dá)父系來源的等位基因,而母源等位基因處于印記狀態(tài)。
2、H19表達(dá)一種功能尚不清楚的RNA,其印記狀態(tài)與IGF2相反,目前發(fā)現(xiàn)H19在正常組織內(nèi)均為母源等位基因表達(dá),父源等位基因印記。印記基因表達(dá)異常包括印記丟失(Loss of imprinting, LOI)和印記獲得(Gain of imprinting, GOI),近年來大量的研究表明,印記異常是某些惡性腫瘤重要的分子生物學(xué)特征,這種表遺傳學(xué)改變可能是癌變機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。幾乎所有的印記基因中都有一些區(qū)域在兩個(gè)不同親本來源的等位基因中
3、僅有一方是甲基化,這些序列被稱為“差異甲基化區(qū)域”(Differentially methylated regions, DMRs)或“印記控制區(qū)”(Imprinting control region, ICR)。針對(duì)小鼠的一系列刪失實(shí)驗(yàn)證明,H19上游的ICR可調(diào)控IGF2和H19的印記狀態(tài);在人結(jié)腸癌、骨肉瘤等惡性腫瘤中也發(fā)現(xiàn)H19上游DMR(H19DMR)的甲基化狀態(tài)與IGF2和/或H19的印記異常有關(guān)。 原發(fā)性肝癌是嚴(yán)重
4、威脅人類健康的重要疾病之一,其發(fā)病率和死亡率均很高,尤其在亞洲和南非地區(qū),但目前關(guān)于人肝癌中的印記狀態(tài)及調(diào)控機(jī)制的研究報(bào)道尚不多見。本課題擬通過同時(shí)檢測(cè)人原發(fā)性肝癌中IGF2和H19的印記改變及H19DMR的甲基化狀態(tài),研究這三者與肝癌的關(guān)系;同時(shí)分析三者之間的相互關(guān)系,探討肝癌中H19DMR在IGF2/H19印記調(diào)控中的作用,從而為揭示IGF2和H19基因的印記調(diào)控機(jī)制積累更名的資料。 材料與方法:收集36例原發(fā)性肝癌患者手術(shù)
5、切除的肝癌組織和5例細(xì)胞株標(biāo)本(肝癌細(xì)胞株Bel-7402、SMMC-7721、HepG2、Huh-7,胚肝細(xì)胞株L-02),以7例健康人肝組織作為正常對(duì)照。利用IGF2第九外顯子內(nèi)有一單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)與ApaⅠ酶切位點(diǎn)重疊和H19第五外顯子內(nèi)有一單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)與RsaⅠ酶切位點(diǎn)重疊的特性,采用PCR-RFLP方法分析各個(gè)標(biāo)本的基因型,對(duì)IGF2或H19多態(tài)位點(diǎn)雜合的標(biāo)本,用RT-PCR-RFLP方法分析其印記狀態(tài);同時(shí)用測(cè)序方法篩選
6、H19DMR內(nèi)3個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)雜和的標(biāo)本,并將其基因組DNA用亞硫酸氫鈉/氫醌修飾后擴(kuò)增出包含上述3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的H19DMR片斷,連入T-載體,克隆并測(cè)序,根據(jù)胞嘧啶是否被轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶分析各標(biāo)本中每條等位基因的甲基化狀態(tài)。 結(jié)果:48例待測(cè)標(biāo)本中,共篩出25例(7例正常肝,17例肝癌,1例細(xì)胞株)IGF2雜合標(biāo)本,14例(3例正常肝,11例肝癌)H19雜合標(biāo)本,25例(5例正常肝,20例肝癌)H19DMR雜合標(biāo)本。正常人肝
7、組織中,IGF2呈雙等位基因表達(dá),H19呈單等位基因表達(dá),H19DMR呈等位基因特異的差異甲基化狀態(tài)。多態(tài)位點(diǎn)雜合的肝癌組織標(biāo)本中,47.1%(8/17)檢測(cè)到IGF2的印記獲得,45.5%(5/11)檢測(cè)到H19的印記丟失,IGF2和H19的印記之間沒有明顯的相關(guān)性(P>0.05)。50.0%(10/20)的H19DMR雜合肝癌標(biāo)本中檢測(cè)到一種或多種H19DMR狀態(tài)異常,而且與IGF2/H19印記改變密切相關(guān)(P<0.05)。其中20
8、.0%(4/20)檢測(cè)到H19DMR等位基因特異的低甲基化改變,但與IGF2的印記獲得無關(guān)(P>0.05),對(duì)H19的印記丟失也不是必要條件;35%(7/20)的肝癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了H19DMR區(qū)域兩條等位基因數(shù)量失衡現(xiàn)象,而且H19DMR甲基化等位基因的減少或非甲基化等位基因的增加與IGF2 GOI相伴隨,而H19DMR非甲基化等位基因的減少或甲基化等位基因的增加與H19 LOI相伴隨。 結(jié)論:正常成人肝組織中IGF2為雙等位基因
9、表達(dá),H19為單等位基因表達(dá),H19DMR保持了差異甲基化狀態(tài);IGF2的印記獲得與H19的印記丟失是人原發(fā)性肝癌中的頻發(fā)事件,但在肝癌中IGF2與H19的等位基因表達(dá)呈相對(duì)獨(dú)立性;人原發(fā)性肝癌中H19DMR等位基因特異的異常低甲基化比其異常高甲基化更常見;人原發(fā)性肝癌中H19DMR的異常甲基化狀態(tài)與IGF2和H19的印記改變密切相關(guān),但不是充分條件,提示在人原發(fā)性肝癌中,除了H19DMR第六CTCF結(jié)合位點(diǎn)附近區(qū)域甲基化狀態(tài)的改變,可
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