重癥失血性休克及復(fù)蘇條件下大鼠VAP-1表達(dá)規(guī)律及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、[背景]
　　 基于目前重度失血性休克救治中靶向治療手段的缺乏，以及創(chuàng)傷失血性休克相關(guān)基礎(chǔ)研究與臨床的脫節(jié)，急切需要我們重新審視已知對(duì)創(chuàng)傷失血性休克病理的認(rèn)識(shí)。前期，我們?cè)谝环N相對(duì)接近臨床的肝左外葉切除+2.5ml/100g(體重)的大鼠創(chuàng)傷失血性休克模型上，摸索到24小時(shí)死亡率接近50％的干預(yù)條件，之后對(duì)存活和死亡大鼠失血前肝臟進(jìn)行表達(dá)譜基因研究，篩查出約100個(gè)差異基因，隨后對(duì)這些差異基因進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。數(shù)據(jù)表明有18個(gè)基

2、因參與了這些差異基因的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，結(jié)合專(zhuān)業(yè)知識(shí)，AOC3基因由于其編碼蛋白具有細(xì)胞粘附功能及SSAO活性而進(jìn)入我們視野。
　　 AOC3基因所編碼的蛋白是一個(gè)由763個(gè)氨基酸組成的含銅胺氧化酶(CAOs)，稱(chēng)為VAP-1。VAP-1是一種具有雙重功能的蛋白。一方面作為內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子(VAP-1)可誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附至血管內(nèi)皮；另一方面作為胺氧化酶(SSAO)可催化芳香族和脂肪族的伯胺類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醛類(lèi)，并產(chǎn)生H2O2和NH3。通

3、過(guò)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)我們發(fā)現(xiàn)VAP-1蛋白的功能與重癥休克期微循環(huán)障礙及血管反應(yīng)性降低有密切聯(lián)系。因此我們認(rèn)為VAP-1在重癥休克病理過(guò)程中可能具有重要意義，有必要進(jìn)行研究闡明，以期為臨床救治重癥休克提供一種新的治療手段。
　　 [目的]
　　 1、明確大鼠定壓失血性休克-復(fù)蘇過(guò)程中肝臟組織AOC3基因及其編碼蛋白VAP-1表達(dá)的變化規(guī)律；
　　 2、明確大鼠定壓失血性休克-復(fù)蘇過(guò)程中血液中sVAP-1含量及SSAO酶活性

4、的變化規(guī)律；
　　 3、構(gòu)建AOC3過(guò)表達(dá)腺病毒載體，為下一步體外功能實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)；
　　 4、檢測(cè)AOC3過(guò)表達(dá)重組腺病毒對(duì)大鼠肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染作用；
　　 5、明確低氧環(huán)境中大鼠肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞AOC3基因及其編碼蛋白VAP-1的表達(dá)規(guī)律。
　　 [方法]
　　 1、大鼠定壓失血性休克模型的建立；
　　 2、通過(guò)大鼠定壓失血性休克模型在休克-復(fù)蘇過(guò)程中的既定時(shí)間點(diǎn)采集大鼠肝臟組織標(biāo)本

5、，通過(guò)Real-timePCR、Western-Blot及免疫組化等方法檢測(cè)休克-復(fù)蘇各階段AOC3基因及其編碼蛋白VAP-1的表達(dá)情況；
　　 3、通過(guò)大鼠定壓失血性休克模型采集大鼠休克-復(fù)蘇既定時(shí)間點(diǎn)的外周血，使用ELISA法及分光光度計(jì)分別檢測(cè)休克-復(fù)蘇過(guò)程不同階段sVAP-1含量及SSAO酶活性；
　　 4、AOC3過(guò)表達(dá)腺病毒載體的設(shè)計(jì)、構(gòu)建、病毒包裝、大量擴(kuò)增、濃縮及滴定測(cè)定，用腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞

6、并測(cè)定MOI值；
　　 5、用重組腺病毒及空病毒轉(zhuǎn)染大鼠肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞，并通過(guò)降低細(xì)胞培養(yǎng)箱氧濃度制造低氧環(huán)境。使用Real-timePCR、Western-Blot檢測(cè)大鼠肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞在腺病毒轉(zhuǎn)染前后在常氧條件及低氧條件下其AOC3基因及編碼蛋白VAP-1的表達(dá)情況。
　　 [結(jié)果]
　　 1、建立了穩(wěn)定的大鼠定壓失血性休克模型；
　　 2、在定壓失血性休克-復(fù)蘇過(guò)程中，Real-timePCR結(jié)果顯

7、示肝臟組織AOC3基因表達(dá)量休克組顯著高于復(fù)蘇組及對(duì)照組，復(fù)蘇組顯著高于對(duì)照組；
　　 3、在定壓失血性休克-復(fù)蘇過(guò)程中，Western-blot結(jié)果顯示在肝臟組織VAP-1/GAPDH蛋白濃度比值休克組顯著高于復(fù)蘇組及對(duì)照組，復(fù)蘇組明顯高于對(duì)照組；
　　 4、大鼠定壓失血性休克-復(fù)蘇過(guò)程中，ELISA定量結(jié)果顯示血清中sVAP-1含量休克組顯著高于復(fù)蘇組及對(duì)照組，復(fù)蘇組顯著高于對(duì)照組。SSAO酶活性測(cè)定結(jié)果顯示血清中酶

8、活性休克組顯著高于復(fù)蘇組及對(duì)照組，復(fù)蘇組顯著高于對(duì)照組；
　　 5、成功建立AOC3過(guò)表達(dá)腺病毒載體(pIRES-EGFP-AOC3)，重組腺病毒感染大鼠腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞的MOI值選取5-10為最佳；
　　 6、在常氧及低氧培養(yǎng)條件下，Real-timePCR結(jié)果均顯示大鼠肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)重組腺病毒轉(zhuǎn)染后其AOC3表達(dá)量顯著高于轉(zhuǎn)染前，而該細(xì)胞經(jīng)空病毒轉(zhuǎn)染前后的AOC3表達(dá)量無(wú)顯著差異。Western-blot結(jié)果顯示相

9、同的趨勢(shì)；
　　 7、Real-timePCR結(jié)果顯示無(wú)論大鼠肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞是否經(jīng)重組腺病毒或空病毒轉(zhuǎn)染，在低氧培養(yǎng)條件下其AOC3表達(dá)量均顯著高于常氧培養(yǎng)條件。Western-blot結(jié)果雖然顯示相同的趨勢(shì)，但差異并不如Real-timePCR結(jié)果顯著。
　　 [結(jié)論]
　　 1、體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)大鼠重癥休克病程中肝臟組織及血清中VAP-1的含量升高，血清中SSAO酶活性增強(qiáng)，而隨著復(fù)蘇的進(jìn)行，各組織中VAP-1含