慢性應激誘導的抑郁大鼠空間學習記憶能力障礙及機制.pdf

1、背景：抑郁是一種常見的神經精神疾病，以持久而顯著的心境障礙為主要特征，患者不僅出現(xiàn)情緒紊亂、睡眠障礙、食欲不佳，而且出現(xiàn)包括注意力、學習能力、記憶能力、決策能力、執(zhí)行能力等方面的認知功能障礙。世界衛(wèi)生組織最新數(shù)據(jù)顯示，全球約有3.5億名患者，其中每年自殺死亡人數(shù)約100萬人，已經成為世界第四大疾病。此外，抑郁也是重要的神經退行性疾病阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，A D)的重要危險因素之一。
　　抑郁由社會、

2、生理、心理等多因素相互作用而導致，其中應激是抑郁發(fā)病的重要誘因。神經影像學檢測發(fā)現(xiàn)抑郁患者前額葉皮層、杏仁核、海馬等變小，并隨著病程的延長、抑郁的反復發(fā)作而更為顯著。尸檢結果也證實了抑郁患者海馬、杏仁核、前額葉皮層等腦區(qū)的萎縮。海馬是承擔空間學習記憶的重要腦區(qū)，也參與情緒調節(jié)，其在抑郁發(fā)病過程中的作用備受關注。而空間學習能顯著增加海馬神經元數(shù)量、提高海馬相關的認知能力。抑郁患者下丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamic-pitui

3、tary-adrenal axis，H P A a x is)功能紊亂明顯，并伴有血清糖皮質激素（Glucocorticoid，GC)水平升高。GC是機體重要的一大類應激激素，短期內升高可以幫助機體抵御外界刺激，而持續(xù)升高則對機體產生不利影響。海馬富含糖皮質激素受體（Glucocorticoid receptor，G R),尸檢發(fā)現(xiàn)抑郁患者海馬中G R的mRNA和蛋白水平均有下降。以上研究提示海馬在抑郁病理進程中發(fā)揮重要作用，但是抑郁發(fā)

4、病中海馬損傷的機制仍不清楚，而改善海馬功能能否改善抑郁癥狀等關鍵科學問題有待深入研究。
　　死亡相關蛋白激酶1(Death-associated protein kinase1，DAPK1)通過不同的途徑參與多種腦疾?。ㄈ缒X卒中、A D)中的神經元損傷：在腦卒中發(fā)生過程中，DAPK1激活并誘導神經元凋亡；在 AD發(fā)生過程中，DAPK1激活并通過過度磷酸化微管相關蛋白ta u而引起神經元退行性變性。胞外信號調節(jié)蛋白激酶/核糖體S6激

5、酶1(Extracellular signal-regulated protein kinase/ribosomal S6 kinase1，ERK/RSK1)是詰抗其損傷的重要信號分子。DAPK1是否參與抑郁發(fā)病、海馬損傷與DAPK1激活有什么聯(lián)系，這些問題至今尚無研究報道。
　　目的：研究慢性應激誘導的抑郁大鼠是否出現(xiàn)海馬損傷，明確抑郁大鼠海馬損傷的機制，研究提高抑郁大鼠海馬功能是否能改善抑郁癥狀。
　　方法：選取3月齡雄

6、性SD大鼠，每天隨機給予某一種刺激，包括束縛2小時、夜間照明、禁食24小時、禁水24小時、高溫（45℃)、冰水游泳（4℃)、夾尾、足底電擊（電流強度0.5 mA)，總共21天。大鼠刺激前后都應用曠場、強迫游泳、糖水偏好實驗評價大鼠抑郁程度，并篩選造模成功的抑郁大鼠，然后使用Morris水迷宮實驗檢測抑郁大鼠空間學習記憶是否受損。使用Bruker小動物磁共振成像儀在體檢測應激后大鼠海馬體積。采用Nissl染色檢測大鼠海馬的神經元數(shù)量，Go

7、lgi染色檢測樹突棘數(shù)量及分類。使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測應激后大鼠血清和海馬皮質酮水平。通過免疫組織化學染色和免疫印跡技術檢測糖皮質激素受體及相關分子在海馬的變化。為觀察改善海馬功能對抑郁行為的影響，我們給予抑郁大鼠7天的水迷宮學習，學習結束后進行抑郁相關行為學及生化、形態(tài)學檢測。為研究抑郁大鼠海馬神經元數(shù)量減少的機制，我們通過免疫印跡檢測了 GC(10-4 M)處理的N2a細胞、GC(KT4 M)處理的下調DAPK1的N2a細胞、上調D

8、APK1的N2a細胞中DAPK1、ERK、RSK1活性及凋亡與自噬相關分子的變化。
　　結果：應激后的大鼠在曠場實驗中出現(xiàn)自發(fā)活動減弱，在強迫游泳實驗中靜止時間明顯延長，在糖水偏好實驗中糖水消耗百分比降低31.6％,說明慢性應激能夠誘導大鼠抑郁樣行為。在 Morris水迷宮實驗中，對照大鼠第5、6天尋找平臺的潛伏期分別為13.1秒和12.8秒，而且在第7天的檢測中首次穿越平臺區(qū)域的潛伏期為13.2秒、60秒內穿越平臺的次數(shù)為3.1

9、次。與對照大鼠相比，抑郁大鼠第5、6天大鼠尋找平臺的潛伏期顯著增加，分別為28.4秒和26.2秒；在第7天的檢測中首次穿越平臺區(qū)域的潛伏期顯著增加，為23.8秒；60秒內穿越平臺的次數(shù)顯著減少，為1.7次。在第14天的檢測中，抑郁大鼠首次穿越平臺區(qū)域的潛伏期為36.1秒，顯著高于對照大鼠(12.5秒），并且在60秒內穿越平臺的次數(shù)為1.6次，顯著低于對照大鼠（3.9次)。以上數(shù)據(jù)說明抑郁大鼠不僅短期記憶能力受損，長期記憶能力也同樣受損。

10、
　　長時程增強（Long term potentiation,LTP)是學習記憶的功能學基礎。本研究中通過刺激內嗅區(qū)前穿質纖維(Perforant path，PP)并記錄海馬齒狀回(Dentate gyms，D G)即 P P-D G通路的LTP。抑郁大鼠興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potential，ffiP S P)斜率第55-60分鐘降低至對照組的67.9%,第85-90分

11、鐘降低至對照組的69.4%，說明抑郁大鼠海馬LTP的誘導障礙。磁共振成像檢測發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠海馬體積比對照組減少18.9%。Nissl染色顯示抑郁大鼠海馬CA1、CA3、D G區(qū)神經元數(shù)量比對照大鼠相應區(qū)域分別減少18.8%、21.2%、18.9%。G o lg i染色后顯示抑郁大鼠海馬CA1、CA3、D G區(qū)樹突棘數(shù)量分別減少31.1%、37.1%、41.6%,蘑菇型樹突在CA1、CA3、D G區(qū)所占比例分別下降46.7%、48.1%、5

12、2.4%。以上結果說明抑郁大鼠出現(xiàn)了海馬結構與功能障礙。
　　進一步通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠血清和海馬組織中皮質酮水平分別升高169.7%、116.5%；免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠海馬G R水平減少21.9%、其 Ser211位點磷酸化程度（pS211-GR)減少了30.4%。大鼠腦片免疫組織化學染色顯示了 G R、PS211-GR同樣的變化趨勢。提示G R活性降低。
　　為研究DAPK1在抑郁大鼠海馬神經元損傷中的作用

13、及機制，通過免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠海馬D A P K1增加193%; E R K總量減少27.3%，E R K磷酸化（p-ERK)水平降低88.2%,提示E R K活性下降;R S K1總量下降37.8%，pS380-RSK下降64.5%,提示R S K1活性下降;含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase3，Caspase3)增加60.8%、Caspase3剪切片

14、段增加193.2%，提不凋亡激活;Beclinl增加52.5%、微管相關蛋白輕鏈3 II（Microtubule-associated protein light chain3 II，LC3 II)增加45.7%，提示自噬體形成增多。免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠海馬CA1、CA3、D G區(qū)DAPK1著色程度變深，海馬CA1、CA3、D G區(qū)DAPK1分別增加143.7%、72.9%、91.5%,并且DAPK1在神經元內的分布發(fā)生改變，由

15、神經元突起轉移至神經元胞體中。抑郁大鼠海馬C A1、C A3區(qū)E R K分別降低18.7%、28.9%；海馬CA1、C A3區(qū)p-ERK水平分別降低47.6%、38.4%。
　　體外用糖皮質激素（104 M)處理N2a細胞24小時后，與無GC處理的細胞相比，DAPK1增加56.5%、Caspase3總量增加180.3%、Caspase3剪切片段增加119.9%、Beclinl增加192.6%、LC3 II增加50.3%、ERK總量

16、減少40.6%、p-ERK降低68.6%、RSK1總量下降28.2%、pS380-RSK減少68.6%。
　　N2a細胞中轉染siDAPKl質粒48小時，GC(10-4 M)處理24小時，與質粒載體對照組比較DAPK1表達降低70.4%、E R K總量增加46.4%、p-ERK增加134.6%、RSK1總量增加119.0%、pS380-RSK增加49.1%、Caspase3總量減少68.9%、Caspase3剪切片段減少68.6%

17、、Beclinl減少77.5%、L C3總量減少26.4%、LC3 II減少49.3%。
　　與轉染質粒載體的對照組比較，N2a細胞中過表達DAPK1質粒48小時后,DAPK1表達增加70.4%、E R K總量減少75.5%、p-ERK減少63.7%、R S K1總量減少59.0%、PS380-RSK減少81.5%。以上研究結果提示應激后糖皮質激素水平升高可顯著激活DAPK1、進而誘導神經元凋亡、自噬體增加；同時，DAPK1激活抑

18、制了ERK和RSK1活性，減少了 ERK和RSK1對DAPK1誘導凋亡的拮抗作用。
　　為進一步證實海馬在抑郁進程中的重要性，我們給予抑郁大鼠7天的水迷宮學習訓練，經過7天空間學習的抑郁大鼠在水迷宮中尋找平臺的潛伏期顯著降低，在曠場試驗中5分鐘內的穿越的總格子數(shù)（水平得分）為66.2,比學習前顯著增加；雙上肢上抬攀爬箱壁次數(shù)（垂直得分）為15.08次，比學習前顯著增加；運動總路程為14.37米，比學習前顯著增加。強迫游泳實驗中，經

19、過空間學習的抑郁大鼠在水中的靜止時間由154.3秒縮短為74.8秒，比學習前顯著減少。糖水偏好實驗中經過空間學習的抑郁大鼠糖水消耗百分比為75.9%,比學習前的46.5%有明顯增加，說明其抑郁樣的行為有明顯改善。而未經過空間學習的抑郁大鼠的上述行為學觀察指標無顯著變化。
　　Golgi染色研究發(fā)現(xiàn)，經過空間學習的抑郁大鼠海馬CA1、CA3、D G區(qū)樹突棘密度分別為4.97/10μm、5.01/10μm、5.12/10μm,比未經過

20、空間學習的抑郁大鼠相應區(qū)域的樹突棘密度顯著增加，其中蘑菇型樹突棘所占的比例也分別增加37.0%、38.6%、43.0%。免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，與未經過空間學習的抑郁大鼠相比，經過空間學習的抑郁大鼠海馬DAPK1水平降低81.4%、ERBC增加36.2%、p-ERK增加42.4%、RSK1增加63.6%、p380-RSK增加73.8%、Caspase3降低126.7%、Caspase3剪切片段降低236.3%、Beclin1降低91.6%、L

21、C3 II降低92.4%。
　　以上結果說明空間學習能顯著改善抑郁大鼠的抑郁行為；降低DAPK1的激活、提高ERK和RSK1活性是其中的關鍵機制。
　　結論：本研究發(fā)現(xiàn)慢性應激誘導的抑郁大鼠出現(xiàn)空間學習記憶能力顯著減低、海馬神經元及樹突棘數(shù)量減少；應激后皮質酮水平升高、DAPK1激活并誘導凋亡細胞增加可能是其中的關鍵機制之一；空間學習改善抑郁大鼠的抑郁程度，可能與空間學習抑制DAPK1激活、增強海馬ERK和RSK1活性密切相