嵌合HAdV六鄰體抗原表位rFLU-HAdV-Hexon疫苗株的拯救及免疫效果研究.pdf

1、應用PR8流感病毒為疫苗載體，將腺病毒六鄰體保護性抗原表位重組到PR8流感病毒NS1基因中，拯救表達腺病毒六鄰體保護性抗原表位的重組PR8流感病毒嵌合疫苗，并觀測其免疫保護效果。在此基礎上應用冷適應、減毒流感病毒株為載體，將腺病毒六鄰體保護性抗原表位重組到冷適應、減毒流感病毒NA基因中，拯救表達腺病毒六鄰體保護性抗原表位的重組冷適應、減毒流感病毒嵌合疫苗，并觀測其免疫原性及免疫保護效果。
　　本研究主要包括以下二部分內容：

2、　　第一部分、以PR8流感病毒為載體的rFLU/HAdV/NS1-H疫苗候選株的初步研究
　　方法與結果：
　　1.應用反向遺傳學技術，以流感病毒PR8為載體，將HAdV六鄰體蛋白抗原表位的基因插入流感病毒非結構蛋白NS基因中，構建重組質粒NS1-Hexon，將重組質粒與PR8流感病毒其他7個基因組質粒共轉染COS1-MDCK共培養(yǎng)細胞，經HA、RT-PCR、間接免疫熒光（IFA）、WB、電鏡等方法證明拯救出的重組病毒為rF

3、LU/HAdV/NS1-H疫苗株。
　　2.rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株接種雞胚擴增、30％-60%蔗糖密度梯度純化，測定其血凝效價為215，每1mL rFLU/HAdV/NS1-H病毒液含有1×106.5TCID50單位，其抗原蛋白含量為6.15mg/mL。
　　3.選用6周齡的雌性BALB/c小鼠，接種rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株為實驗組，同時設立104TCID50和105TCID50兩個劑量組，并用0.

4、01M PBS為對照組。小鼠按20μL/只劑量進行滴鼻免疫，0、28天，免疫兩次。免疫前、一免4周和二免2周收集小鼠血清、肺鼻灌洗液及脾淋巴細胞懸液。應用微量中和法、ELISA法測定免疫小鼠血清針對PR8流感病毒和HAdV-3的中和抗體效價以及針對HAdV-3的抗體亞型IgG、IgG1和IgG2a滴度；應用ELISPOT法測定小鼠脾淋巴細胞懸液針對PR8流感病毒和HAdV-3細胞因子IL-4和IFN-γ分泌水平；應用ELISA法測定小鼠

5、肺鼻灌洗液針對HAdV-3特異性的sIgA抗體效價。結果表明，rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株在小鼠體內能夠產生針對PR8流感病毒和HAdV-3的中和抗體，產生針對HAdV-3的體液免疫、細胞免疫及粘膜免疫反應，與PBS對照組比較差異顯著（p<0.05或p<0.01）。同時，105TCID50劑量組免疫效果優(yōu)于104TCID50劑量組。
　　4.rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株二次免疫BALB/c小鼠二周后，A/PR/8/

6、34(H1N1)流感病毒和HAdV-3病毒進行攻毒，結果顯示，rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株能夠明顯減輕PR8流感病毒和HAdV-3病毒感染后癥狀、有效降低肺鼻的病毒載量、顯著改善肺組織的病理病變情況，保護小鼠抵抗PR8流感病毒的致死性攻擊。
　　結論：
　　成功拯救rFLU/HAdV/NS1-H疫苗株，其能夠刺激小鼠機體產生較好的體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫效應。rFLU/HAdV/NS1-H免疫的小鼠對HAdV-3

7、攻毒具有較好的保護效果。
　　第二、以冷適應減毒A/California/07/2009流感病毒為載體的rFLU/HAdV/NA-H減毒疫苗候選株的初步研究
　　方法與結果：
　　1.將驗證的HAdV六鄰體蛋白的抗原表位基因插入A/California/07/2009流感病毒表面基因NA特定位點中，構建重組質粒NA-Hexon，以A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)型流感病毒為骨架病毒，將其6個內部基因(P

8、B1、PB2、PA、NP、M、NS)與A/California/07/2009流感病毒HA基因及重組質粒NA-Hexon構建到雙向表達載體pAD3000上，共轉染COS1-MDCK共培養(yǎng)細胞，經HA、RT-PCR、WB、電鏡等方法證明拯救出的重組病毒為rFLU/HAdV/NA-H疫苗株。
　　2.rFLU/HAdV/NA-H疫苗株接種雞胚擴增，經30%-60%蔗糖密度梯度純化，測定其血凝效價為216，每1mL rFLU/HAdV/

9、NA-H病毒液含有1×107TCID50單位，其抗原蛋白含量為7.32mg/mL。
　　3.6周齡的雌性BALB/c小鼠，接種rFLU/HAdV/NA-H疫苗株為實驗組（設立105TCID50和106TCID50兩個劑量組），并用0.01M PBS為對照組。小鼠按20μL/只劑量進行滴鼻免疫，0、28天，免疫兩次。免疫前、一免4周和二免2周收集小鼠血清、肺鼻灌洗液及脾淋巴細胞懸液。應用微量中和法、ELISA法測定免疫小鼠血清針對B

10、J501流感病毒、HAdV-3和HAdV-7病毒的中和抗體效價以及針對HAdV-3和HAdV-7的抗體亞型IgG、IgG1和IgG2a滴度；應用ELISPOT法測定小鼠脾淋巴細胞懸液針對BJ501流感病毒、HAdV-3和HAdV-7病毒細胞因子IL-4和IFN-γ水平；應用ELISA法測定小鼠肺鼻灌洗液中針對HAdV-3和HAdV-7特異性的sIgA抗體效價。結果表明，rFLU/HAdV/NA-H疫苗株在小鼠體內能夠產生針對BJ501流

11、感病毒、HAdV-3和HAdV-7病毒的中和抗體，產生針對HAdV-3和HAdV-7的體液免疫、細胞免疫及粘膜免疫反應，與PBS對照組比較差異顯著（p<0.05或p<0.01）。同時，106TCID50劑量組免疫效果優(yōu)于105TCID50劑量組。
　　4.rFLU/HAdV/NA-H疫苗株二次免疫BALB/c小鼠二周后，選用BJ501(H1N1)流感病毒和HAdV-3、HAdV-7病毒進行攻毒，結果顯示，rFLU/HAdV/NA-