熱激啟動(dòng)子AtHSP70b的克隆與功能改進(jìn)研究.pdf

1、獲得或構(gòu)建可準(zhǔn)確調(diào)控的植物基因啟動(dòng)子而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因表達(dá)的精確調(diào)控，使目的基因定時(shí)、定量和定位的表達(dá)，是轉(zhuǎn)基因植物中控制目的基因表達(dá)的主要和有效手段。目前研究最多的是利用外源誘導(dǎo)物誘導(dǎo)啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，但這種誘導(dǎo)方式存在物種局限性、藥物殘留和成本高等多種缺陷。熱激啟動(dòng)子是受溫度誘導(dǎo)時(shí)啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，與其他誘導(dǎo)型啟動(dòng)子相比，它克服了利用外源誘導(dǎo)物對(duì)植物及環(huán)境等方面所帶來(lái)的不良影響，便于對(duì)目的基因進(jìn)行經(jīng)濟(jì)、有效和精確地調(diào)控，因此倍受人們的關(guān)注，但

2、迄今為止克隆的熱激啟動(dòng)子幾乎都存在表達(dá)遺漏問(wèn)題，給熱激啟動(dòng)子的實(shí)際應(yīng)用帶來(lái)了困難。本研究克隆了擬南芥熱激基因啟動(dòng)子AtHSP70b，詳細(xì)分析了它在轉(zhuǎn)基因煙草中的熱激表：特性，并對(duì)其序列進(jìn)行了改造，獲得了的嚴(yán)謹(jǐn)性和靈敏性表達(dá)的人工熱激基因啟動(dòng)子HSP70m，為今后對(duì)一些目的基因進(jìn)行精確的熱激調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下： 1.擬南芥熱激啟動(dòng)子AtHSP70b的克隆根據(jù)擬南芥熱激啟動(dòng)子AtHSP70b基因序列設(shè)計(jì)兩個(gè)特異性引物Pri

3、m1(TATATCCCGGTCGGTGAATC)和Prim2(GGAAGTGAGGTTTTTCGATTTC)，采用高保真的pfuDNA聚合酶，從擬南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia生態(tài)型植株基因組DNA中，通過(guò)PCR擴(kuò)增出目標(biāo)片段。純化后的目標(biāo)片段經(jīng)TaqDNA聚合酶加A堿基后，采用TACloning的方法克隆到pMD18-T載體中，得到重組質(zhì)粒pMD-AtHSP70b，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，挑取白色

4、的重組子單菌落進(jìn)行PCR篩選和質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證。委托上海生工生物工程有限公司對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序。結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增的目標(biāo)片段為204bp，與已發(fā)表的擬南芥熱激啟動(dòng)子AtHSP70b的序列一致。 2.人工熱激啟動(dòng)子HSP70m的設(shè)計(jì)、合成及序列測(cè)定將擬南芥熱激啟動(dòng)子AtHSP70b序列中的不完善熱激元件改造成完善的熱激元件(nnGAAnnTTCnnGAAnn)并剔除其他已知的潛在順式元件，設(shè)計(jì)出人工熱激啟動(dòng)子HSP70m的調(diào)控區(qū)域，委

5、托上海生工生物工程有限公司合成該片段的序列。將人工合成的HSP70m的調(diào)控區(qū)域與從pSAU2006中PCR擴(kuò)增得到的-46mini35S：GUS片段連接后，通過(guò)TACloning方法克隆到pMD18-T載體中，得到重組質(zhì)粒pM-HSP70mGUS5，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，挑取白色的單菌落進(jìn)行PCR篩選，將檢驗(yàn)得到的陽(yáng)性重組子單菌落送上海生工測(cè)序。序列結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)的序列一致，表明已構(gòu)建成人工熱激啟動(dòng)子HSP70m。 3.

6、植物表達(dá)載體的構(gòu)建質(zhì)粒pMD-AtHSP70b和pM-HSP70mGUS5分別經(jīng)EcoRⅠ+XbaⅠ雙酶切后回收含有AtHSP70b和HSP70m啟動(dòng)子的大片段，分別與從質(zhì)粒pSAU2006經(jīng)EcoRⅠ+XbaⅠ酶切后回收的GUS-Tnos片段相連接，得到了分別含有AtHSP70b-GUS-Tnos和HSP70m-GUS-Tnos基因表達(dá)盒的中間載體pM-HSP70bGUS和pM-HSP70mGUS。該中間載體再經(jīng)EcoRⅠ+HindⅢ

7、雙酶切后回收AtHSP70b-GUS-Tnos和HSP70m-GUS-Tnos基因表達(dá)盒片段，分別與pVCT2020的EcoRⅠ+HindⅢ酶切大片段連接，得到雙元植物表達(dá)載體pV-HSP70bGUS和pV-HSP70mGUS。 4.AtHSP70b-GUS和HSP70m-GUS基因?qū)霟煵莼蚪M以無(wú)菌煙草葉片為材料，用農(nóng)桿菌LBA4004/pV-HSP70bGUS和LBA4004/pV-HSP70mGUS作菌株，經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)、抑

8、菌培養(yǎng)和150m/L的Kan抗性篩選后得到煙草的抗性愈傷組織和抗性芽。將抗性芽轉(zhuǎn)到MS+0.2mg/LNAA+糖30g/L+瓊脂7.0g/L+300mg/LCb+150mg/LKan的抗性生根培養(yǎng)基中，獲得具有Kan抗性的煙草轉(zhuǎn)基因植株。待煙草再生苗長(zhǎng)至5片葉左右時(shí)將移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中。取轉(zhuǎn)基因煙草的葉片用CTAB法提取其基因組DNA，以熱激啟動(dòng)子AtHSP70b和人工熱激啟動(dòng)子HSP70m上游端的引物Prim1及GUS中間部位的引物Pri

9、m6為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)AtHSP70b-GUS基因的植株基因組DNA能擴(kuò)增出673bp的目標(biāo)條帶，與質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照相一致。轉(zhuǎn)HSP70m-GUS基因的植株基因組DNA能擴(kuò)增出586bp的目標(biāo)條帶，與質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照相吻合。表明目的基因AtHSP70b-GUS和HSP70m-GUS已分別整合進(jìn)到煙草基因組中。 5.熱激啟動(dòng)子AtHSP70b和人工熱激啟動(dòng)子HSP70m在煙草中的熱激誘導(dǎo)表達(dá)特性分析兩種轉(zhuǎn)基因的煙草植株的

10、葉圓片在不同溫度下處理，經(jīng)過(guò)GUS組織化學(xué)染色后發(fā)現(xiàn)：在轉(zhuǎn)AtHSP70b-GUS基因的煙草中GUS基因的表達(dá)活性隨著溫度的升高而增強(qiáng)，表明熱激啟動(dòng)子AtHSP70b的活性隨溫度的升高表達(dá)活性增強(qiáng)，但沒(méi)有明顯的溫度誘導(dǎo)界限。AtHSP70b-GUS基因在常溫下和4℃低溫下也有不同程度的表達(dá)，表明AtHSP70b熱激誘導(dǎo)表達(dá)不嚴(yán)謹(jǐn)，存在非高溫下的表達(dá)遺漏。在轉(zhuǎn)HSP70m-GUS基因的煙草中，人工熱激啟動(dòng)子HSP70m只在29℃～38℃范

11、圍內(nèi)才會(huì)表達(dá)，此溫度范圍內(nèi)啟動(dòng)子HSP70m的表達(dá)活性隨溫度的升高而增強(qiáng)，而低于29℃或高于38℃時(shí)均不表達(dá)，表明該人工熱激啟動(dòng)子具有受高溫嚴(yán)緊性誘導(dǎo)的表達(dá)特性，達(dá)到了對(duì)熱激啟動(dòng)子AtHSP70b改造的預(yù)期目的。 6.植物表達(dá)載體pV-HSP70mGUS對(duì)番茄的遺傳轉(zhuǎn)化將在番茄分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2天的番茄子葉和莖段投入到活化的農(nóng)桿菌LBA4404(pV-HSP70mGUSinLBA4404)菌液中浸染8～10分鐘。經(jīng)共培養(yǎng)、抑菌