熱激啟動子AtHSP70b的克隆與功能改進研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩65頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)

文檔簡介

1、獲得或構(gòu)建可準確調(diào)控的植物基因啟動子而實現(xiàn)對目的基因表達的精確調(diào)控,使目的基因定時、定量和定位的表達,是轉(zhuǎn)基因植物中控制目的基因表達的主要和有效手段。目前研究最多的是利用外源誘導(dǎo)物誘導(dǎo)啟動基因轉(zhuǎn)錄,但這種誘導(dǎo)方式存在物種局限性、藥物殘留和成本高等多種缺陷。熱激啟動子是受溫度誘導(dǎo)時啟動基因轉(zhuǎn)錄,與其他誘導(dǎo)型啟動子相比,它克服了利用外源誘導(dǎo)物對植物及環(huán)境等方面所帶來的不良影響,便于對目的基因進行經(jīng)濟、有效和精確地調(diào)控,因此倍受人們的關(guān)注,但

2、迄今為止克隆的熱激啟動子幾乎都存在表達遺漏問題,給熱激啟動子的實際應(yīng)用帶來了困難。本研究克隆了擬南芥熱激基因啟動子AtHSP70b,詳細分析了它在轉(zhuǎn)基因煙草中的熱激表:特性,并對其序列進行了改造,獲得了的嚴謹性和靈敏性表達的人工熱激基因啟動子HSP70m,為今后對一些目的基因進行精確的熱激調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下: 1.擬南芥熱激啟動子AtHSP70b的克隆根據(jù)擬南芥熱激啟動子AtHSP70b基因序列設(shè)計兩個特異性引物Pri

3、m1(TATATCCCGGTCGGTGAATC)和Prim2(GGAAGTGAGGTTTTTCGATTTC),采用高保真的pfuDNA聚合酶,從擬南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia生態(tài)型植株基因組DNA中,通過PCR擴增出目標片段。純化后的目標片段經(jīng)TaqDNA聚合酶加A堿基后,采用TACloning的方法克隆到pMD18-T載體中,得到重組質(zhì)粒pMD-AtHSP70b,轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue,挑取白色

4、的重組子單菌落進行PCR篩選和質(zhì)粒的酶切驗證。委托上海生工生物工程有限公司對陽性克隆測序。結(jié)果表明,PCR擴增的目標片段為204bp,與已發(fā)表的擬南芥熱激啟動子AtHSP70b的序列一致。 2.人工熱激啟動子HSP70m的設(shè)計、合成及序列測定將擬南芥熱激啟動子AtHSP70b序列中的不完善熱激元件改造成完善的熱激元件(nnGAAnnTTCnnGAAnn)并剔除其他已知的潛在順式元件,設(shè)計出人工熱激啟動子HSP70m的調(diào)控區(qū)域,委

5、托上海生工生物工程有限公司合成該片段的序列。將人工合成的HSP70m的調(diào)控區(qū)域與從pSAU2006中PCR擴增得到的-46mini35S:GUS片段連接后,通過TACloning方法克隆到pMD18-T載體中,得到重組質(zhì)粒pM-HSP70mGUS5,轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue,挑取白色的單菌落進行PCR篩選,將檢驗得到的陽性重組子單菌落送上海生工測序。序列結(jié)果與預(yù)期設(shè)計的序列一致,表明已構(gòu)建成人工熱激啟動子HSP70m。 3.

6、植物表達載體的構(gòu)建質(zhì)粒pMD-AtHSP70b和pM-HSP70mGUS5分別經(jīng)EcoRⅠ+XbaⅠ雙酶切后回收含有AtHSP70b和HSP70m啟動子的大片段,分別與從質(zhì)粒pSAU2006經(jīng)EcoRⅠ+XbaⅠ酶切后回收的GUS-Tnos片段相連接,得到了分別含有AtHSP70b-GUS-Tnos和HSP70m-GUS-Tnos基因表達盒的中間載體pM-HSP70bGUS和pM-HSP70mGUS。該中間載體再經(jīng)EcoRⅠ+HindⅢ

7、雙酶切后回收AtHSP70b-GUS-Tnos和HSP70m-GUS-Tnos基因表達盒片段,分別與pVCT2020的EcoRⅠ+HindⅢ酶切大片段連接,得到雙元植物表達載體pV-HSP70bGUS和pV-HSP70mGUS。 4.AtHSP70b-GUS和HSP70m-GUS基因?qū)霟煵莼蚪M以無菌煙草葉片為材料,用農(nóng)桿菌LBA4004/pV-HSP70bGUS和LBA4004/pV-HSP70mGUS作菌株,經(jīng)過共培養(yǎng)、抑

8、菌培養(yǎng)和150m/L的Kan抗性篩選后得到煙草的抗性愈傷組織和抗性芽。將抗性芽轉(zhuǎn)到MS+0.2mg/LNAA+糖30g/L+瓊脂7.0g/L+300mg/LCb+150mg/LKan的抗性生根培養(yǎng)基中,獲得具有Kan抗性的煙草轉(zhuǎn)基因植株。待煙草再生苗長至5片葉左右時將移栽到營養(yǎng)缽中。取轉(zhuǎn)基因煙草的葉片用CTAB法提取其基因組DNA,以熱激啟動子AtHSP70b和人工熱激啟動子HSP70m上游端的引物Prim1及GUS中間部位的引物Pri

9、m6為引物對進行PCR擴增。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)AtHSP70b-GUS基因的植株基因組DNA能擴增出673bp的目標條帶,與質(zhì)粒陽性對照相一致。轉(zhuǎn)HSP70m-GUS基因的植株基因組DNA能擴增出586bp的目標條帶,與質(zhì)粒陽性對照相吻合。表明目的基因AtHSP70b-GUS和HSP70m-GUS已分別整合進到煙草基因組中。 5.熱激啟動子AtHSP70b和人工熱激啟動子HSP70m在煙草中的熱激誘導(dǎo)表達特性分析兩種轉(zhuǎn)基因的煙草植株的

10、葉圓片在不同溫度下處理,經(jīng)過GUS組織化學(xué)染色后發(fā)現(xiàn):在轉(zhuǎn)AtHSP70b-GUS基因的煙草中GUS基因的表達活性隨著溫度的升高而增強,表明熱激啟動子AtHSP70b的活性隨溫度的升高表達活性增強,但沒有明顯的溫度誘導(dǎo)界限。AtHSP70b-GUS基因在常溫下和4℃低溫下也有不同程度的表達,表明AtHSP70b熱激誘導(dǎo)表達不嚴謹,存在非高溫下的表達遺漏。在轉(zhuǎn)HSP70m-GUS基因的煙草中,人工熱激啟動子HSP70m只在29℃~38℃范

11、圍內(nèi)才會表達,此溫度范圍內(nèi)啟動子HSP70m的表達活性隨溫度的升高而增強,而低于29℃或高于38℃時均不表達,表明該人工熱激啟動子具有受高溫嚴緊性誘導(dǎo)的表達特性,達到了對熱激啟動子AtHSP70b改造的預(yù)期目的。 6.植物表達載體pV-HSP70mGUS對番茄的遺傳轉(zhuǎn)化將在番茄分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2天的番茄子葉和莖段投入到活化的農(nóng)桿菌LBA4404(pV-HSP70mGUSinLBA4404)菌液中浸染8~10分鐘。經(jīng)共培養(yǎng)、抑菌

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論