人腦脊液對人類脂肪間充質干細胞及胎兒神經前體細胞增殖、凋亡及遷移特性的影響.pdf

1、對于中樞神經系統(tǒng)多種難治性疾病而言，間充質干細胞和神經前體細胞被認為是理想的細胞資源，這兩類細胞具有促進組織修復、攜帶特殊靶向藥物、對損傷部位定向遷移的能力。然而在中樞神經系統(tǒng)微環(huán)境的影響下，這些細胞資源原有的特殊性能是否會發(fā)生變化，目前尚不十分清楚。由于腦脊液是構成人類中樞神經系統(tǒng)微環(huán)境的重要組成部分，因此研究這兩類細胞在腦脊液的環(huán)境下，其特性的改變，將對于干細胞用于中樞系統(tǒng)的臨床試驗至關重要。本研究主要探索人腦脊液對人類脂肪間充質干

2、細胞及胎兒神經前體細胞在增殖、凋亡、遷移等方面的影響，從而為優(yōu)化干細胞在中樞神經系統(tǒng)的臨床應用提供參考。
　　本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 人腦脊液對人類脂肪間充質干細胞及胎兒神經前體細胞增殖及凋亡的影響
　　目的：觀察人腦脊液（Human cerebrospinal fluid,H-CSF）對人脂肪間充質干細胞（human adipose-derived mesenchymal stem cells

3、，hAMSCs）及胎兒神經前體細胞（human fetal-derived neural progenitor cells，hfNPCs）增殖及凋亡的影響。
　　方法：收集正常顱內壓腦積水（normal pressure hydrocephalus）或先天性腦積水（congenital hydrocephalus）病人的腦脊液（H-CSF），同時配制人工腦脊液（Artificial cerebrospinal fluid，A-CS

4、F）。用100％MSC完全培養(yǎng)基（對照組，Ctrl）、25％A-CSF+75％MSC完全培養(yǎng)基（人工腦脊液組，A-CSF）以及25％H-CSF+75％MSC完全培養(yǎng)基（人腦脊液組，H-CSF）培養(yǎng)hAMSCs；用100％NPC完全培養(yǎng)基（對照組，Ctrl）、25％A-CSF+75％NPC完全培養(yǎng)基（人工腦脊液組，A-CSF）以及25％ H-CSF+75％ NPC完全培養(yǎng)基（人腦脊液組，H-CSF）培養(yǎng)hfNPCs。用MTT、免疫熒光染色

5、（Ki67）測定hAMSCs和hfNPCs的增值能力；用流式細胞檢測Propidium iodide（PI）和Annexin V，并而分析兩類細胞的凋亡比例。
　　結果：與Ctrl和A-CSF相比，hAMSCs在H-CSF環(huán)境下，增殖力能明顯增加（MTT assay,H-CSF vs.Ctrl: p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05;Ki67 assay,H-CSF vs.Ctrl: p<0.05;H-CSF

6、vs.A-CSF:p<0.05），凋亡比例下降（H-CSF vs.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05）。同時，相對于Ctrl和A-CSF組，H-CSF可增加hfNPCs的增殖能力（MTT assay,H-CSF vs.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05;Ki67 assay,H-CSF vs.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05），降低其凋亡比

7、例（H-CSF vs.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05）。此外，用不同濃度的H-CSF（0％，25％，50％，75％，100％）培養(yǎng)hAMSCs和hfNPCs，其增殖能力有所不同。
　　結論：H-CSF可促進hAMSCs及hfNPCs的增殖，并抑制兩類細胞的凋亡。
　　第二部分 人腦脊液對人類脂肪間充質干細胞和胎兒神經前體細胞運動及遷移的影響
　　目的：探討H-CSF對hAMSCs及h

8、fNPCs運動速度、運動距離以及遷移能力的影響及其相關特點。
　　方法：將hAMSCs及hfNPCs在不同條件下（Ctrl，A-CSF及H-CSF）培養(yǎng)，并種植于底面為納米材料的小憩室內，動態(tài)觀察兩類細胞的運動速度和運動距離。用MATLAB軟件分析不同培養(yǎng)條件對hAMSCs和hfNPCs運動能力的影響。同時用Boyden transwell chambers實驗測定兩類細胞在不同培養(yǎng)條件下，對膠質母細胞瘤（Glioblastoma

9、,GBM）條件培養(yǎng)基的遷移能力，并分析H-CSF對hAMSCs和hfNPCs遷移能力的影響。
　　結果：通過對兩類細胞在納米材料表面的運動狀態(tài)的觀察，并利用MATLAB軟件分析hAMSCs和hfNPCs的速度和距離。發(fā)現，相對Ctrl和A-CSF組，H-CSF可增加hAMSCs的運動速度和運動距離（speed,H-CSF vs.Ctrl:p<0.05; H-CSF vs.A-CSF: p<0.05;distance,H-CSF v

10、s.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05）。同時H-CSF對hfNPCs的運動能力亦有促進作用（speed,H-CSF vs.Ctrl: p<0.05; H-CSF vs.A-CSF: p<0.05;distance, H-CSF vs.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05）。通過Boyden transwell chambers實驗發(fā)現，H-CSF可提高hAMSCs和 hfN

11、PCs的對GBM條件培養(yǎng)基的遷移能力（hAMSCs,H-CSF vs.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs. A-CSF: p<0.05;hfNPCs, H-CSF vs.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05)。此外，本研究發(fā)現，在預處理時間一定的情況下（48hours），培養(yǎng)基中H-CSF的濃度越高，hAMSCs和hfNPCs對GBM條件培養(yǎng)基的遷移能力越強。
　　結論：H-CSF可提高hAMS

12、Cs及hfNPCs的運動速度和運動距離，并可促進hAMSCs和hfNPCs的遷移能力。
　　第三部分 人腦脊液中IGF-1對人類脂肪間充質干細胞和胎兒神經前體細胞特性的影響
　　目的：探討H-CSF中胰島素樣生長因子1（IGF-1）對hAMSCs及hfNPCs特性的影響及其機制。
　　方法：測定所收集H-CSF標本中IGF-1的含量，并用IGF-1拮抗劑（IGF-1 inhibitor）拮抗H-CSF中的IGF-1。將

13、hAMSCs及hfNPCs在不同條件下（Ctrl， Ctrl+IGF-1 inhibitor，H-CSF及H-CSF+IGF-1 inhibitor）培養(yǎng)，觀察hAMSCs及hfNPCs的增殖、凋亡、運動及遷移能力，并探討其部分機制。
　　結果：H-CSF中的IGF-1可影響hAMSCs和hfNPCs的增殖能力及凋亡比例。MTT實驗證實，當IGF-1 inhibiotr加入H-CSF時，hAMSCs及hfNPCs的增殖能力相對未加

14、入IGF-1 inhibitor組（H-CSF組）明顯下降（hAMSCs，H-CSF+IGF-1 inhibitor vs.H-CSF:p<0.05；hfNPCs，H-CSF+IGF-1 inhibitor vs.H-CSF:p<0.05）。流式細胞實驗證實，H-CSF中的IGF-1亦可影響 hAMSCs和hfNPCs的凋亡比例（hAMCs,H-CSF+IGF-1 inhibitor vs.H-CSF:p<0.05;hfNPCs,H-C

15、SF+IGF-1 inhibitor vs.H-CSF:p<0.05）。同時，本研究發(fā)現，H-CSF中的IGF-1可調控hAMSCs及hfNPCs的遷移能力，H-CSF+IGF-1 inhibitor組相對于H-CSF組而言，兩類細胞的遷移能力明顯降低（hAMCSs,H-CSF+IGF-1 inhibitor vs.H-CSF: p<0.05;hfNPCs,H-CSF+IGF-1 inhibitor vs.H-CSF:p<0.05）。此

16、外，H-CSF+IGF-1 inhibitor相對于H-CSF組，其hAMSCs和hfNPCs細胞膜表面表達的基質細胞衍生因子受體(Cxc Chemokin Receptor4,CXCR4)亦有下降（hAMSCs,H-CSF+IGF-1 inhibitor vs.H-CSF:p<0.05;hfNPCs,H-CSF+IGF-1 inhibitorvs.H-CSF:p<0.05）。
　　結論：H-CSF中的IGF-1可影響hAMSCs