地黃低聚糖對脂肪組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、抗凋亡及旁分泌作用影響的研究.pdf

1、背景：一種脂肪來源的成體干細(xì)胞，被稱作脂肪組織源性間充質(zhì)干細(xì)胞(adiposetissue-derived mesenchymal stromal cells，ADMSCs)，具有分化為心肌、肉皮、神經(jīng)等多種組織的潛能。人體脂肪組織來源豐富，而且能從抽脂術(shù)中廢棄的脂肪中獲取，損傷小，患者易接受，因而容易分離得到大量的ADMSCs。因此，ADMSCs作為種子細(xì)胞有希望進(jìn)行心肌等組織再生的治療。2007年1月，西班牙在世界上首次將從腹部脂肪

2、中提取的成人干細(xì)胞經(jīng)導(dǎo)管移植到患者心臟中，進(jìn)行針對心絞痛和心臟病的試驗性治療。但目前國內(nèi)對其治療心血管疾病相關(guān)機(jī)制的基礎(chǔ)研究還很有限，限制了其臨床應(yīng)用。我國是中醫(yī)中藥的發(fā)祥地，具有豐富的中醫(yī)藥資源，本研究嘗試使用中藥成分改善ADMSCs移植后的轉(zhuǎn)化率及存活率，為中醫(yī)藥在心肌梗死及心力衰竭防治上的應(yīng)用開辟新的研究領(lǐng)域。地黃低聚糖(Rehmanniaglutinosaoligosacc-haride，RGO)系從地黃中提取的地黃多糖中進(jìn)一步

3、分離提取的有效成分，分子量為1000-3000，由60％的四糖和20％的三糖為主要成分構(gòu)成。本研究旨在觀察地黃低聚糖對脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、抗凋亡保護(hù)作用及旁分泌作用的影響，為RGO應(yīng)用于促進(jìn)ADMSCs移植效率提供實驗依據(jù)。 目的：一是觀察RGO對ADMSCs增殖的影響；二是觀察RGO對過氧化氫誘導(dǎo)的ADMSCs凋亡的保護(hù)作用；三是觀察RGO對ADMSCs分泌VEGF和HGF的影響。 內(nèi)容和方法：根據(jù)以上目的，本研

4、究分為三個部分： 第一部分從腹部外科手術(shù)患者術(shù)后廢棄的脂肪組織中分離、培養(yǎng)、鑒定人ADMSCs，免疫組織化學(xué)方法鑒定其表面分子CD44、CD105、CD45、CD34的表達(dá)，應(yīng)用不同濃度的地黃低聚糖IMDM(0、1mg/L、10mg/L、100mg/L、400mg/L)體外培養(yǎng)hADMSCs，應(yīng)用MTT比色法檢測RGO對ADMSCs增殖能力的影響。 第二部分將分離、培養(yǎng)的ADMSCs隨機(jī)分成3組：正常對照組(N組)，無特

5、殊處理：H2O2組(H組)，加入終濃度0.1mmol/L的H2O2；地黃低聚糖+H2O2組(R組)，加入終濃度0.2g/L的地黃低聚糖和終濃度0.1mmol/L的H2O2。三組干預(yù)時間分別設(shè)為1、6、24h，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，觀察RGO對ADMSCs抗H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。 第三部分應(yīng)用不同濃度的地黃低聚糖IMDM(0、1mg/L、10mg/L、100mg/L、400mg/L)體外分別培養(yǎng)ADMSCs，培養(yǎng)7

6、2h后，用ELISA法測定不同培養(yǎng)基中VEGF和HGF的含量． 結(jié)果： 培養(yǎng)的ADMSCsCD44、CD105細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果為陽性，而CD34、CD45均為陰性。MTT結(jié)果示，與對照組相比，1mg/L組及10mg/L組RGO對人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞的生長均無明顯促進(jìn)作用(P＞0.05)，100mg/L組RGO對人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞的生長呈顯著的促進(jìn)作用(P＜0.01)，400mg/L組RGO對人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞的

7、生長亦有明顯的促進(jìn)作用(P＜0.01)。100mg/L組與400mg/L組相比，二者對hADMSCs的促進(jìn)作用亦有明顯差別，100mg/L組對增殖的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于400mg/L組(P＜0.05)。 干預(yù)1，6和24h后，H組較N組凋亡率均顯著升高(P＜0.01)，1、6和24h后，R組較H組細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P＜0.01)，即RGO減少了H2O2誘導(dǎo)的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡。 將ADMSCs培養(yǎng)72h后，100

8、mg/L組與400mg/L組的VEGF和HGF含量明顯升高(P＜0.01)，且100mg/L組較400mg/L組升高明顯(P＜0.05)。根據(jù)細(xì)胞群體的倍增時間計算培養(yǎng)72h后各組細(xì)胞的數(shù)量，并計算每1×105細(xì)胞上清液中VEGF和HGF的含量，結(jié)果各組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論： 1、一定濃度的地黃低聚糖對hADMSCs的增殖能力具有促進(jìn)作用。 2、地黃低聚糖可減輕H2O2誘導(dǎo)的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡。