地黃低聚糖對(duì)同種異體脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞移植治療小型豬急性心肌梗死效應(yīng)及機(jī)制的研究.pdf

1、背景：盡管急性心肌梗死（AMI）的治療取得了一定進(jìn)步，但仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。干細(xì)胞移植治療AMI是一種很有潛力的方法，但缺血心肌局部惡劣的微環(huán)境嚴(yán)重阻礙了其療效的發(fā)揮。
　　目的：評(píng)價(jià)地黃低聚糖（RGOs）對(duì)同種異體脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞（ASCs）移植治療小型豬AMI的療效，探討其可能的機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分：熱水法提取生地黃中的RGOs，經(jīng)陽(yáng)離子和陰離子交換樹脂洗脫，活性炭柱層析純化RGOs，以高效液相色譜法（

2、HPLC）檢測(cè)其水蘇糖含量。
　　第二部分：酶消化法及貼壁法從小型豬腹股溝脂肪組織中分離、培養(yǎng)ASCs，流式細(xì)胞儀鑒定其分子表型；CCK-8法觀察不同濃度RGOs對(duì)ASCs增殖的影響。
　　第三部分：人ASCs（hASCs）經(jīng)RGOs(0.1mg/ml)預(yù)處理12h并繼續(xù)干預(yù)，ELISA法觀察不同時(shí)間點(diǎn)hASCs培養(yǎng)上清液中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1），堿性成纖維

3、細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-lα（SDF-lα）濃度的變化。
　　第四部分：過(guò)氧化氫（200μM）聯(lián)合血清饑餓（H2O2/SD，6h）模擬氧化應(yīng)激微環(huán)境，誘導(dǎo)小型豬ASCs凋亡。觀察RGOs（0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、10mg/ml）預(yù)處理12h并繼續(xù)干預(yù)對(duì)ASCs凋亡的影響。AnnexinV-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性，酶標(biāo)儀比色法測(cè)定細(xì)胞caspase-3的

4、活性，Western-blot法測(cè)定細(xì)胞Bax、Bcl-2的表達(dá)。
　　第五部分：17頭小型豬隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（C組，n=5），單純RGOs組（R組，n=4），單純ASCs移植組（A組，n=4），RGOs+ASCs聯(lián)合治療組（RA組n=4）。球囊封堵左前降支90分鐘構(gòu)建小型豬AMI模型，造模1周后（7～10天）經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植同種異體ASCs（0.8×106/kg）。RGOs組造模前3天及造模后1月飼以RGOs粗提物（4g,2/

5、日）。移植后8周，MRI評(píng)價(jià)各組心臟結(jié)構(gòu)及功能變化，熒光顯微鏡及激光共聚焦掃描觀察ASCs存活及分化，免疫組織化學(xué)法觀察梗死區(qū)域微血管密度，Masson三色染色法評(píng)價(jià)梗死區(qū)纖維化程度，TUNEL法檢測(cè)梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡，Westernblot法測(cè)定梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞Bax、Bcl-2的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　第一部分：地黃粗提物及提純物得率分別為地黃原藥材的41.64％和35.14%，HPLC法檢測(cè)RGOs提純物中水蘇糖

6、占31.15%。
　　第二部分：成功從小型豬腹股溝脂肪組織中分離并培養(yǎng)了ASCs，第四代ASCs分子表型CD29、CD44、CD90、CD105呈陽(yáng)性表達(dá)，而CD31、CD34、CD45、HLA-DR均呈陰性表達(dá)。RGOs在一定濃度范圍(0.01mg/ml～1mg/ml)內(nèi)對(duì)體外培養(yǎng)的小型豬ASCs具有促增殖作用，最佳濃度為0.1mg/ml。
　　第三部分：RGOs（0.1mg/ml）可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的hASCs分泌VEGF

7、、HGF、IGF-1、SDF-1α，但對(duì)于bFGF的分泌無(wú)明顯影響，其促旁分泌作用具有一定的時(shí)效性。
　　第四部分：RGOs在一定濃度范圍(0.1mg/ml～10mg/ml)可以減輕H2O2/SD引起的ASCs損傷，表現(xiàn)在細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞活性增加，caspase-3活性降低，Bax表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)上調(diào)。
　　第五部分：與C組比較，僅RA組可以明顯改善左心室功能，增加梗死區(qū)室壁厚度,減小左心室質(zhì)量指數(shù)及梗死體積（p

8、<0.05）；RA組ASCs的存活多于A組（p<0.01）；RA組梗死區(qū)域微血管密度明顯高于其他3組（p<0.01），而3組間無(wú)顯著差異；與C組比較，A組以及RA組均能明顯降低梗死區(qū)纖維化程度（p<0.05，p<0.01）；與C組比較，R組及RA組均能明顯減少心肌細(xì)胞凋亡（p<0.05，p<0.01）；與C組比較，三組Bax的表達(dá)均明顯下降（p<0.01），R組及RA組Bcl-2的表達(dá)明顯升高（p<0.01）。
　　結(jié)論：RGOs