環(huán)孢菌素A-納米乳增強(qiáng)脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞移植治療小型豬急性心肌梗死療效研究.pdf

1、背景：干細(xì)胞移植到心臟受心肌梗死后惡劣微環(huán)境影響，導(dǎo)致細(xì)胞大量凋亡甚至死亡。因此，如何提高干細(xì)胞移植成活率就成為干細(xì)胞治療領(lǐng)域最大的挑戰(zhàn)。環(huán)孢菌素(CsA)是臨床廣泛應(yīng)用的高效免疫抑制劑。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),環(huán)孢菌素A能抑制細(xì)胞凋亡，因而得以在心血管領(lǐng)域應(yīng)用。然而長(zhǎng)期應(yīng)用環(huán)孢菌素A可能帶來(lái)的肝、腎毒性卻限制了該藥在臨床的大規(guī)模應(yīng)用。借鑒腫瘤化療藥物的靶向遞藥的成功經(jīng)驗(yàn)，我們制造并評(píng)估了負(fù)載環(huán)孢菌素A的納米乳(CsA-NP)。由于納米微粒能修

2、飾藥物在體內(nèi)的重新分布，因而有望達(dá)到靶向、高效、低毒的療效。
　　目的：因此，本項(xiàng)研究將評(píng)估CsA-NP是否能增強(qiáng)脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞(ASCs)移植治療小型豬急性心肌梗死療效及可能機(jī)制。
　　方法：第一部分：CsA-NP采用高壓均質(zhì)法制備而成。采用高效液相色譜法(HPLC)評(píng)估產(chǎn)品的載藥率，乳徑的粒徑經(jīng)激光粒度分析儀測(cè)定。
　　第二部分：評(píng)估CsA-NP在體外對(duì)ASCs增殖和分化的影響。提取小型豬腹股溝脂肪組織經(jīng)分離、

3、培養(yǎng)和擴(kuò)增。ASCs表面標(biāo)記物經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定。ASCs增殖和分化采用細(xì)胞直接計(jì)數(shù)和MTT檢測(cè)。
　　第三部分：評(píng)估CsA-NP保護(hù)ASCs抗凋亡作用及可能機(jī)制。采用過(guò)氧化氫（H2O2）體外誘導(dǎo)ASCs凋亡模型,Annexin-VFITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ASCs細(xì)胞凋亡,細(xì)胞活性和Caspase-3活性檢測(cè)分別采用CCK-8試劑Caspase-3試劑，cytochromec的表達(dá)采用Westernblot分析。

4、　　第四部分：延遲增強(qiáng)核磁共振（DE-MRI）評(píng)估經(jīng)皮球囊封堵冠狀動(dòng)脈法制備小型豬急性心肌梗死模型。
　　第五部分：17頭AMI后存活的小型豬分為四組：control組(n=5)；CsA-NP組,（n=4);ASCs組（n=4);ASCs和CsA-NP聯(lián)合移植組(CsA-NP+ASCs組,n=4)。AMI后1周經(jīng)冠脈內(nèi)注入ASCs或PBS。干細(xì)胞移植前和干細(xì)胞移植后8周，DE-MRI評(píng)估心臟結(jié)構(gòu)和功能。病理組化評(píng)估移植后心肌和移植

5、細(xì)胞情況。
　　結(jié)果：第一部分：本研究制備的CsA-NP工藝穩(wěn)定性好，粒徑均勻，50％的乳滴微粒直徑在162nm以內(nèi)。
　　第二部分：檢測(cè)結(jié)果提示ASCs分子表型CD29、CD44、CD90、CD105均呈陽(yáng)性表達(dá)，而CD31、CD34、CD45、HLA-DR均呈陰性表達(dá)。CsA-NP濃度在（0.01-1mg/ml）之間對(duì)細(xì)胞增殖有明顯促進(jìn)作用（P<0.01）;其中又以0.5mg/ml的CsA-NP劑量組為最佳。5mg/ml

6、以上對(duì)細(xì)胞增殖幾乎沒(méi)有影響。
　　第三部分：細(xì)胞形態(tài)（細(xì)胞皺縮、凋亡小體形成和DNA片段化）和生化結(jié)果檢測(cè)顯示H2O2能誘導(dǎo)ASCs凋亡,但CsA-NP(0.1-10mg/ml)作用24小時(shí)后能抑制H2O2誘導(dǎo)的ASCs凋亡，其中又以5mg/ml濃度組為最佳（P<0.001）。H2O2誘導(dǎo)的ASCs線粒體內(nèi)跨膜電位坍塌可部分被CsA-NP(0.1-10mg/ml)抑制。CsA-NP(0.1-10mg/ml)可下調(diào)caspase-3

7、活性，而且Western-blot結(jié)果顯示CsA-NP(5mg/ml)可完全抑制H2O2誘導(dǎo)的cytochromeC釋放。
　　第四部分：有17只小型豬心肌梗死造模后存活，成功率54.8%(17/31)。MRI顯示心肌梗死面積為10.2±2.9(cm3)。與對(duì)照組比較，AMI組CO、LVEF和SV均明顯下降(P<0.001)；而LVEDV和LVESV均升高（P<0.05）。DE-MRI與后期的左室短軸病理切片結(jié)果相呼應(yīng)。
　

8、　第五部分：與對(duì)照組比較，ASCs和CsA-NP+ASCs組的LVEDV、LVESV升高顯著(P<0.05)。與CsA-NP和ASCs組比較，CsA-NP+ASCs組的LVEF提升尤其明顯(P<0.01)，而梗死面積和室壁厚度下降顯著，梗死中心和梗死邊緣的血管增生明顯(P<0.01)，而其它三組無(wú)顯著性差異。與ASCs組比較，CsA-NP+ASCs組DAPI和免疫熒光顯示心肌表面標(biāo)記物α-actin,cTn-T,vWF分化顯著增多(P<

9、0.01)。Masson纖維染色顯示ASCs和CsA-NP+ASCs組的纖維增生顯著下降(分別為P<0.05,P<0.01)。TUNEL顯示ASCs和CsA-NP+ASCs組心肌細(xì)胞凋亡明顯減輕(分別為P<0.05,P<0.01)。CsA-NP+ASCs和CsA組caspase-3和cytochromeC水平顯著下降(P<0.05)。
　　結(jié)論：CsA-NP增強(qiáng)了ASCs移植治療小型豬AMI療效，改善了左室重構(gòu)，提高了心功能。心功